響應面優化超聲輔助提取牛鼻栓枝皮多糖工藝

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(1.安徽師范大學生命科學院,安徽蕪湖 241000;2.皖南醫學院藥學院,安徽蕪湖 241000;3.安徽師范大學環境科學與工程學院,安徽蕪湖 241000)

響應面優化超聲輔助提取牛鼻栓枝皮多糖工藝

馬志慧1,王曉英1,包淑云2,黃克強1,周守標1,3,*

(1.安徽師范大學生命科學院,安徽蕪湖 241000;2.皖南醫學院藥學院,安徽蕪湖 241000;3.安徽師范大學環境科學與工程學院,安徽蕪湖 241000)

以牛鼻栓枝皮為材料,采用超聲波提取法優化多糖的提取工藝。在單因素實驗的基礎上,選取液料比、提取時間、提取溫度及提取功率為影響因素,多糖提取量為響應值,結合響應面分析法確定牛鼻栓枝皮多糖的提取條件,得到最佳提取工藝為:液料比為50∶1 (mL/g),提取時間為59 min,提取溫度為66 ℃,提取功率為180 W,此條件下的多糖提取量為11.43 mg/g。與傳統熱提法相比,超聲波提取多糖效率更高。

牛鼻栓枝皮,多糖,超聲波,響應面法

牛鼻栓(FortuneariasinensisRehd. et Wils)為金縷梅科單屬種植物,且為我國特有,其分布于湖南、湖北、江蘇、安徽等地[1]。牛鼻栓葉片含有巖白菜素[2-3],對支氣管哮喘、慢性支氣管炎等具有一定的療效。

多糖是一類具有多種重要生理活性的高分子化合物,除了抗衰老、抗輻射、抗病毒外,還有降血糖、降血脂及抑制腫瘤的作用[4-5]。近年來,隨著對多糖研究的深入,其提取方法也在不斷改進,其中超聲波輔助提取的方法由于空化效應,利于溶劑更好地滲透進樣品,具有更為快速、簡便及有效的特點[6-7]。

雖然關于多糖的研究報道很多,但少有關于牛鼻栓多糖的研究報道。為更好地開發利用牛鼻栓,本研究以超聲波法提取牛鼻栓枝皮多糖,通過響應面分析法[8-9],研究各因素與響應面值、各因素兩兩間交互作用的顯著性[10-12],對牛鼻栓枝皮多糖的提取工藝進行優化。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

牛鼻栓枝 采自安徽省滁州市的瑯琊山,由安徽師范大學周守標教授鑒定;石油醚、葡萄糖、無水乙醇、氯仿、正丁醇、苯酚、濃硫酸等均為分析純。

HH系列數顯恒溫水浴鍋 上海江星儀器有限公司;KH5200DE型數控超聲波清洗器 昆山禾創超聲儀器有限公司;SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司;752紫外可見分光光度計 上海佑科儀器儀表有限公司;N-1100旋轉蒸發儀 上海愛朗儀器有限公司;TDZ5-WS臺式低速自動平衡離心機 長沙湘智離心機儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1 牛鼻栓枝皮多糖的提取 取牛鼻栓枝皮晾干,粉碎,過100目篩,用石油醚索氏提取,得到的殘渣自然干燥,取一定量的殘渣按照設定的提取條件加蒸餾水后提取,抽濾,上清液濃縮至10 mL,加3倍體積的95%乙醇醇沉過夜,于4000 r/min離心20 min,沉淀加20 mL蒸餾水溶解,Sevag法脫蛋白[13-14],室溫下于4000 r/min離心10 min,取上清液濃縮后定容至50 mL容量瓶中。

1.2.2 多糖含量的測定 精密稱取葡萄糖20 mg,用蒸餾水溶解并定容至500 mL容量瓶中,分別吸取0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL于具塞試管中,加蒸餾水至1.0 mL,依次加入0.6 mL 5%苯酚溶液,3.6 mL濃硫酸,置沸水浴中30 min,冷卻至室溫后,在490 nm波長處測吸光度,繪制多糖的標準曲線[15-16]。多糖提取的公式為:

牛鼻栓枝皮多糖提取量(mg/g)=提取液中多糖質量(mg)/牛鼻栓枝皮樣品質量(g)

1.2.3 超聲波提取牛鼻栓枝皮多糖的單因素實驗 分別考察不同液料比、不同提取時間、不同提取溫度及不同提取功率對牛鼻栓皮多糖提取量的影響,確定響應面實驗的因素水平。

保持提取時間30 min、提取溫度55 ℃、提取功率200 W不變,研究液料比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1 (mL/g)對牛鼻栓枝皮多糖提取量的影響。

確定最優的液料比,保持提取溫度55 ℃、提取功率200 W不變,研究提取時間15、30、45、60、75 min對牛鼻栓枝皮多糖提取量的影響。

確定最優的液料比與提取時間,固定提取功率200 W,研究提取溫度35、45、55、65、75 ℃對牛鼻栓枝皮多糖提取量的影響。

確定最優的液料比、提取時間與提取溫度,研究提取功率80、120、160、180、200 W對牛鼻栓枝皮多糖提取量的影響。

1.2.4 響應面實驗設計 根據單因素實驗結果,以Box-Behnken實驗設計作為原理,用Design-Expert 8.0.6軟件進行分析,分別以A液料比、B提取時間、C提取溫度、D提取功率為4個因素,以-1、0、1表示其3個水平[17],多糖提取量為響應值,從而得到牛鼻栓枝皮多糖的最佳提取工藝,其因素水平設計見表1。

表1 Box-Behnken實驗設計因素及水平Table 1 Factor and levels used in Box-Behnken experimental design

1.3傳統熱提法與超聲波提取法的比較

依照超聲波提取的最優提取時間、提取溫度及液料比條件,用傳統熱提法[18]提取牛鼻栓枝皮多糖,進行含量測定,并與超聲波提取法進行比較。

1.4數據統計分析

通過響應面法,以牛鼻栓枝皮多糖提取量為響應面值,采用Design-Expert V8.0.6軟件對數據進行處理與回歸分析,得出最優提取工藝。

2 結果與分析

2.1標準曲線的繪制

以葡萄糖的質量濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標,繪制標準曲線,得到回歸方程:y=10.951x+0.0488,R2=0.9993,回歸方程的測定濃度范圍為0.012～0.040 mg/mL,結果見圖1。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Standard curve of dextra

2.2單因素實驗結果

2.2.1 超聲提取液料比對牛鼻栓枝皮多糖的影響 如圖2所示,隨著液料比的增加,牛鼻栓枝皮中多糖提取量不斷增大,在液料比為40∶1 (mL/g)時,達到最大值,之后呈下降趨勢。原因可能是當液料比較小時,牛鼻栓枝皮中的多糖溶解不充分;液料比較大時,溶劑過多,增加了濃縮過程中的時間消耗,而導致提取量降低。綜合考慮,故選擇液料比30∶1、40∶1、50∶1 (mL/g)較適宜。

圖2 料液比對多糖提取量的影響Fig.2 Effect of liquid to solid ratio on the extraction yield of polysaccharides

2.2.2 超聲提取時間對牛鼻栓枝皮多糖的影響 如圖3所示,隨著提取時間的延長,多糖提取量增加;60 min后,多糖提取量隨時間的延長而降低。原因可能是多糖在長時間超聲波的機械振動下,部分多糖大分子被降解成小分子的單糖而造成損失。故選取提取時間30、45、60 min為較優實驗條件。

圖3 提取時間對多糖提取量的影響Fig.3 Effect of extraction time on the extraction yield of polysaccharides

2.2.3 超聲提取溫度對牛鼻栓枝皮多糖的影響 如圖4所示,隨著提取溫度的升高,多糖提取量增大;之后達到65 ℃以后,多糖提取量降低。原因可能是由于溫度的升高,促使溶劑更易進入樣品的顆粒中,使多糖的溶解力增加。綜合考慮,選取55、65、75 ℃作為最適提取溫度。

圖4 提取溫度對多糖提取量的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the extraction yield of polysaccharides

2.2.4 超聲提取功率對牛鼻栓枝皮多糖的影響 如圖5所示,在提取功率在80～180 W時,多糖提取量在不斷增加,之后隨著功率的增加,呈現下降趨勢。原因可能是超聲波功率越大,其空化效應越明顯,能加大溶劑對于多糖的溶解;功率過高,產生的熱量越多,對牛鼻栓枝皮多糖的結構造成一定破壞。故將提取功率160、180、200 W作為較適宜的實驗條件。

圖5 提取功率對多糖提取量的影響Fig.5 Effect of extraction power on the extraction yield of polysaccharides

2.3響應面實驗結果

2.3.1 響應面實驗設計 根據單因素實驗結果及結合Box-Behnken設計原理,進行四因素三水平實驗,結果見表2。

表2 Box-Behnken設計方案及結果Table 2 The Box-Behnken experimental design and results for response surface analysis

表3 回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance for regression

注:*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001。

2.3.2 回歸模型有效性及顯著性分析 依據表2中的結果,利用Design-Expert 8.0.6進行回歸分析,得到牛鼻栓多糖提取量(Y)與液料比(A)、提取時間(B)、提取溫度(C)、提取功率(D)的二次多項回歸方程:

Y=10.69+0.21A+0.60B+0.64C-0.19D+1.28AB-0.76AC+0.14AD+0.21BC+0.52BD+0.59CD-0.42A2-1.03B2-1.84C2-1.29D2

2.3.3 兩因素交互作用分析 液料比、提取時間、提取溫度與提取功率這四個因素兩兩交互作用的三維響應面與等高線圖見圖6。通過響應面圖可知,在所對應的范圍內存在極大值,即為各響應面的最高點,亦為等高線最內橢圓的中心點[14]。

如圖6a所示,液料比與提取時間對牛鼻栓枝皮多糖提取量的交互作用顯著。響應面圖可以看出,當液料比為50∶1 (mL/g),提取時間為60 min時,多糖提取量最高;從等高線圖亦可以看出,提取時間對響應值的影響更大。

如圖6b所示,液料比與提取溫度對牛鼻栓枝皮多糖提取量的交互作用顯著。從3D圖可知,多糖提取量在液料比40∶1 (mL/g)、提取溫度65 ℃時達到最高,等高線曲線斜率反映出提取溫度對多糖提取量影響更明顯。

如圖6c所示,多糖提取量在提取時間45 min、提取功率170 W時,提取效率最高,且提取時間比提取功率對響應值的影響更大,兩者的交互作用較顯著。

如圖6d所示,多糖提取量受提取溫度與提取功率的交互作用影響顯著。其中,提取溫度對多糖的影響占主導。在提取溫度65 ℃,提取功率170 W時,多糖提取量較高。

通過Design-expert 軟件分析得出,牛鼻栓枝皮多糖提取的最佳工藝為:液料比50∶1 (mL/g)、提取時間59 min、提取溫度66 ℃、提取功率172 W。此條件下多糖提取量為11.38 mg/g。

圖6 各因素交互作用對多糖提取量的響應面與等高線圖Fig.6 Response surface plot showing the interactive effects of independent variables on polysaccharide yield

2.4驗證實驗

為了對最優提取工藝進行驗證,結合實際操作的可行性,將Design-expert 軟件得到的最優條件調整為:液料比50∶1 (mL/g)、提取時間59 min、提取溫度66 ℃、提取功率180 W,并在此條件下進行三組平行重復實驗,最終得到的牛鼻栓枝皮多糖的提取量為11.43 mg/g,與預測值的相對誤差為0.44%,差異較小。故利用響應面優化提取牛鼻栓枝皮多糖得到的提取工藝真實可靠,具有一定的實際應用價值。

2.5傳統熱提法與超聲波提取法的比較

牛鼻栓枝皮多糖不同提取方法下,多糖含量不同,傳統熱提多糖提取量為7.85 mg/g,超聲波提取多糖提取量為11.43 mg/g。與傳統熱提法相比,超聲波提取多糖效率更高,即響應面法提取牛鼻栓枝皮多糖具有一定的實際應用價值。

3 結論與討論

本研究通過響應面優化法,對液料比、提取時間、提取溫度及提取功率這四個因素進行考察,并采用Design-Expert 8.0.6軟件進行分析,結果得出,液料比、提取時間與提取溫度對多糖提取量影響顯著,其影響順序為:提取溫度>提取時間>液料比>提取功率。通過二次回歸方程,得到的最優提取工藝為液料比50∶1 (mL/g)、提取時間59 min、提取溫度66 ℃、提取功率180 W,牛鼻栓枝皮多糖的實際平均提取量為11.43 mg/g,提取效率高于傳統熱提法。

本實驗藥材牛鼻栓作為中國特有的植物,目前并未見國內外報道過其多糖成分。本研究通過響應面回歸分析,不僅得出牛鼻栓皮中含有較多量的多糖物質,也優化了超聲波提取的工藝,為牛鼻栓工業生產提供了理論依據,也為其藥用價值的利用奠定了基礎。

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Optimizationofultrasonic-assistedtechnologyforpolysaccharidesextractionfromthebarkofFortuneariasinensisbranchesbyresponsesurface

MAZhi-hui1,WANGXiao-ying1,BAOShu-yun2,HUANGKe-qiang1,ZHOUShou-biao1,3,*

(1.College of Life Science,Anhui Normal University,Wuhu 241000,China; 2.School of Pharmacy,Wannan Medical College,Wuhu 241000,China; 3.College of Environmental Science and Engineering,Anhui Normal University,Wuhu 241000,China)

Ultrasonic-assisted technology was used to optimize the extraction technique of polysaccharides from the bark ofFortuneariasinesisbranches. Based on the results of single factor experiment,the impacting factors was selected including liquid to solid ratio,extraction time,extraction temperature and extraction power,and the extraction yield of polysaccharides as the response value. The extraction conditions of polysaccharides from the bark ofFortuneariasinensisbranches were determined by response surface analysis. The optimum extraction conditions were as follows:liquid to solid ratio was 50∶1 (mL/g),the extraction time was 59 min,the extraction temperature was 66 ℃,and the extraction power was 180 W. The extraction rate of polysaccharide was 11.43 mg/g. Compared with the ultrasonic and traditional hot-water extraction method,ultrasonic extraction efficiency was higher.

the bark ofFortuneariasinensisbranches;polysaccharides;ultrasonic;response surface methodology

2017-02-21

馬志慧(1992-)，女，碩士，研究方向：藥用植物學，E-mail:mazhihui1999@163.com。

*通訊作者:周守標(1963-)，男，博士，教授，研究方向：資源植物學與生物多樣性保護等，E-mail:zhoushoubiao@vip.163.com。

安徽省2016年高校優秀中青年骨干人才國內外訪學研修重點項目(gxfxZD2016153)。

TS201.1

:B

:1002-0306(2017)17-0202-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.17.038