瘤背石磺活性多肽制備工藝優化及其抗氧化性探究

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(上海海洋大學省部共建水產種質資源發掘與利用教育部重點實驗室,上海海洋大學水產與生命學院,上海 201306)

瘤背石磺活性多肽制備工藝優化及其抗氧化性探究

李柏航,沈和定*,朱敏,趙永蠶

(上海海洋大學省部共建水產種質資源發掘與利用教育部重點實驗室,上海海洋大學水產與生命學院,上海 201306)

以瘤背石磺為原料,采用響應面法優化瘤背石磺活性多肽的制備工藝,考察NaCl濃度、液固比、溫度和提取時間對羥基自由基清除率的影響。結果表明:最優提取條件為NaCl濃度0.09%,液固比57 mL/g,提取時間2.5 h,在此條件下羥基自由基清除率最大,預測值為33.09%,實測值為33.34%,實測值與預測值相接近,且相對誤差只有0.76%,表明響應面法得到的最佳提取條件合理可行。天然活性多肽體外抗氧化活性實驗結果表明:其對羥基自由基、DPPH自由基、H2O2有較好清除能力,還具有一定還原能力以及亞鐵離子螯合能力。總體而言,瘤背石磺天然活性多肽表現出一定的體外抗氧化活性,具有良好的開發前景。

瘤背石磺,響應面法,活性多肽,抗氧化性

瘤背石磺(Onchidiumstruma),江浙滬一帶又叫涂龜、土鮑等,屬于軟體動物門(Mollusca)、腹足綱(Gastropoda)、有肺類(Pulmonata)、縮眼目(Systellommatophora)、石磺超科(Onchidioidea)[1]。研究表明,瘤背石磺中含有20多種氨基酸和多種人體所需的微量元素,其營養成分在一定程度上比牡蠣、縊蟶等海洋貝類豐富,具有較高的營養價值[2-3]。此外,石磺還具有很高的藥用價值,一些沿海地區民間流傳石磺有治哮喘、助消化、消除疲勞、明目等作用,是很好的中藥材[4]。

隨著人們對石磺認識的逐漸加深,研究領域不斷拓展,學者們在分類學、生態學、營養學、繁殖生物學、酶學等方面對石磺的研究已經做了大量工作[5-9]。而關于石磺活性肽的研究報道不多,1996年Fernández等[10]從石磺屬(Onchidiumsp.)中提取分離到了一種環縮酚酸肽Onchidin B;2011年Khodabandeh等[11]研究報道,從石磺的卵細胞中分離得到一種對乳腺癌細胞有一定的抑制作用的蛋白質。

本實驗以瘤背石磺為原料,羥自由基清除率為響應值,采用響應面法對瘤背石磺抗氧化肽制備工藝進行優化,考察NaCl濃度、液固比、溫度和提取時間對·OH清除率的影響,以期獲得最優提取條件,制備出抗氧化肽類,并對其進行體外抗氧化活性測定,包括羥自由基、DPPH自由基、H2O2的清除能力,亞鐵離子螯合能力以及還原能力,同時與肌肽的抗氧化能力進行比較,為研究瘤背石磺活性物質提供參考依據。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

瘤背石磺 購于上海崇明島堡鎮,平均體重為(16.41±3.26) g,石磺干粉蛋白含量為(64.38±1.02)%。菲啰啉、肌肽 國藥集團化學試劑有限公司;DPPH Sigma公司;其他試劑 均為分析純。

QSJ-D162電動組織切碎機 廣東小熊電器有限公司;AL104電子分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;HWS-26雙列六孔恒溫水浴鍋 上海慧泰儀器制造有限公司;UB-7pH計 上海皖寧精密科學儀器有限公司;TDZ6B-WS低速臺式離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司;LGJ-12真空冷凍干燥機 北京松源華興科技發展公司;UV-1800PC紫外可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司。

1.2材料預處理

瘤背石磺→洗去泥土→解剖去除內臟→剪成小碎塊→冷凍干燥→研磨成粉→干燥環境下儲存備用。

1.3多肽粗提液制備流程

稱取一定量瘤背石磺干粉→燒杯→加入配好的PBS緩沖液(pH=7.0)→低速磁力攪拌2 h→過濾提取液→低溫高速離心(4 ℃,8000 r/min)20 min→多肽粗提液。

1.4單因素實驗

NaCl濃度對·OH清除率的影響:在液固比=60∶1 (mL/g),溫度=20 ℃,時間=2 h的條件下,調整NaCl濃度為0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%,進行單因素實驗。

液固比對·OH清除率的影響:在NaCl濃度為0.10%,溫度=20 ℃,時間=2 h的條件下,調整液固比為30∶1、60∶1、90∶1、120∶1和150∶1 (mL/g),進行單因素實驗。

溫度對·OH清除率的影響:在NaCl濃度為0.10%,液固比=60∶1 (mL/g),時間=2 h的條件下,調整溫度為20、25、30、35和40 ℃,進行單因素實驗。

提取時間對·OH清除率的影響:在NaCl濃度為0.10%,液固比=60∶1 (mL/g),溫度=20 ℃的條件下,調整時間為1、1.5、2、2.5和3 h,進行單因素實驗。

1.5響應面實驗設計

根據單因素實驗的結果,對瘤背石磺天然活性多肽制備工藝進行響應面實驗設計,選取3個因素:NaCl濃度、液固比、提取時間進行Box-Beknhen實驗設計,表1為實驗因素和水平。

表1 響應面實驗水平編碼表Table 1 Factors and levels of response surface experiences

1.6多肽粗提液抗氧化活性測定

用優化出的工藝條件制備瘤背石磺多肽粗提液,對得到的粗提液進行冷凍干燥,將凍干樣品于-20 ℃密封保存。通過測定清除·OH 能力、清除DPPH·能力、清除H2O2能力、還原能力和亞鐵離子螯合能力來綜合反映瘤背石磺多肽粗提液中抗氧化肽的抗氧化性,并與肌肽的抗氧化性進行比較研究,分析它們之間抗氧化活性的差異。

1.6.1 羥自由基清除活性測定 采用分光光度法[12]。在試管中分別加入0.5 mL樣品液,3.5 mL純水,0.5 mL 0.01 mol/L水楊酸-乙醇溶液,0.5 mL 0.01 mol/L FeSO4溶液,最后加5 mL 0.1 mol/L H2O2啟動Fenton反應,振蕩混合后于37 ℃水浴保溫30 min,于510 nm處測定吸光度A1;用0.5 mL純水代替0.01 mol/L FeSO4溶液,于510 nm處測得吸光度A2;用0.5 mL純水代替樣品液,于510 nm處測得吸光度A3。

·OH清除率計算公式:清除率(%)=[1-(A1-A2)/A3]×100

1.6.2 DPPH自由基清除活性測定 參照劉成梅等[13]的方法,稍作改動。在具塞試管中加入2 mL樣品液和2 mL 1×10-4mol/L DPPH溶液(95%乙醇配制),搖勻后在室溫下密閉避光30 min,于517 nm處測定吸光度A1;用2 mL 95%乙醇溶液代替2 mL 1×10-4mol/L DPPH溶液,測得吸光度A2;用2 mL純水代替2 mL樣品液,測得吸光度A0。

DPPH·清除率計算公式:清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

1.6.3 H2O2清除活性測定 參照王運改[14]的方法并稍加修改。樣品溶于3.4 mL磷酸緩沖液(pH=7.4)中,加入0.6 mL 4 mol/L的H2O2溶液,混勻后靜置10 min,于230 nm處測定吸光度A1;磷酸緩沖液中不加入樣品,測得吸光度A0。

H2O2清除率計算公式:清除率(%)=(A0-A1)/A0×100

1.6.4 還原能力測定 參照王艷梅等[15]的方法并稍加修改。在試管中加入2 mL樣品液,2.5 mL 0.2 mol/L pH6.6的磷酸鹽緩沖液和2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液,混勻后于50 ℃保溫20 min后加入2.5 mL 10%的三氟乙酸,混勻后3000 r/min離心10 min。取2.5 mL上清液,加2.5 mL純水和0.5 mL 0.1% FeCl3,于700 nm處測定吸光度。吸光度越大則說明還原能力越強。

1.6.5 亞鐵離子螯合能力測定 參照王艷梅等[15]的方法。2 mL樣品液中加入2.8 mL純水,混合后再加入0.1 mL 2 mmol/L FeCl2和0.1 mL 5 mmol/L菲啰啉,靜置10 min,于562 nm處測定吸光度A1;用2 mL純水代替2 mL樣品液,測得吸光度A0。

亞鐵離子螯合能力計算公式:螯合能力(%)=(A0-A1)/A0×100

1.7數據分析

每個實驗點做三組平行,結果取平均值。用SPSS分析軟件進行單因素方差分析和顯著性檢驗,利用Design expert軟件進行響應面數據分析。

2 結果與分析

2.1單因素結果分析

2.1.1 NaCl濃度對羥基自由基清除率的影響 由圖1可發現,NaCl濃度對羥基自由基清除率的影響顯著(p<0.05)。羥基自由基清除率在NaCl濃度為0.05%～0.10%時,呈增大的趨勢,在NaCl濃度為0.10%～0.25%時,呈減小的趨勢。分析認為當NaCl濃度為0.10%時,緩沖液中的離子強度最適合瘤背石磺天然活性多肽的溶出。因此,本實驗選取0.10%為最適NaCl濃度。

圖1 NaCl濃度對羥基自由基清除率的影響Fig.1 Influence of NaCl concentration on the clearance rate of hydroxyl radical注：標注不同字母表示數據差異顯著(p<0.05)，圖2～圖4同。

圖2 液固比對羥基自由基清除率的影響Fig.2 Influence of liquid-solid rate on the clearance rate of hydroxyl radical

2.1.2 液固比對羥基自由基清除率的影響 如圖2所示,液固比對羥基自由基清除率的影響顯著(p<0.05)。羥基自由基清除率的變化隨著液固比的增大呈現先升后降的趨勢。由于液固比較低時分子的擴散速度較慢,因此活性多肽溶出較少,隨著液固比的增加,分子擴散速度加快,在60 mL/g時,活性多肽基本溶出,羥基自由基清除率也達到最高值,而后隨著液固比繼續增加,活性多肽在緩沖液中的濃度逐漸降低,羥基自由基清除率也隨之降低。因此,本實驗選取60 mL/g為最適液固比。

2.1.3 溫度對羥基自由基清除率的影響 由圖3可以發現,溫度對羥基自由基清除率的影響不顯著(p>0.05)。在溫度變化的范圍內,羥基自由基清除率變化不明顯。因此,從簡化實驗操作的角度出發,選取20 ℃為最適提取溫度。

圖3 溫度對羥基自由基清除率的影響Fig.3 Influence of temperature on the clearance rate of hydroxyl radical

2.1.4 提取時間對羥基自由基清除率的影響 由圖4可以看出,提取時間對羥基自由基清除率的影響顯著(p<0.05)。隨著提取時間的增加,羥基自由基清除率呈增大的趨勢。其中,在1～1.5 h時,羥基自由基清除率增速較大,1.5～3 h時,羥基自由基清除率增速變緩。因此,從經濟節能的角度出發,選取2 h為最適提取時間。

圖4 提取時間對羥基自由基清除率的影響Fig.4 Influence of enzymolysis time on the clearance rate of hydroxyl radical

2.2響應面結果分析

2.2.1 響應面優化因素確定 使用SPSS軟件對各個單因素進行顯著性方差分析,選擇對羥基自由基清除率影響顯著的幾個因素進行響應面優化實驗。通過分析可以得出NaCl濃度、液固比和提取時間對羥基自由基清除率影響顯著,選擇這三個因素進行響應面優化實驗,其他因素取單因素實驗中的最佳水平。

2.2.2 響應面實驗結果 表2為響應面實驗方案及結果,使用Design Expert對結果進行分析,得到回歸方程為:羥基自由基清除率=33.08-0.26A-0.076B+0.037C-0.062AB+0.000AC+5.000E-003BC-0.93A2-0.30B2-0.040C2。

表2 實驗方案與結果Table 2 Testing program and the results

2.2.3 方差分析 表3為回歸模型及各項方差分析結果。此模型顯著(p<0.0001),相關系數R2為0.9962,說明此模型能解釋99.62%響應值的變化,且失擬項p=0.5199>0.05,不顯著,實驗誤差小。因此,可以用此模型對瘤背石磺活性多肽的制備工藝進行分析和預測。可以發現,一次項中A、B的回歸系數極顯著,說明NaCl濃度和液固比對羥基自由基清除率有極顯著影響;交互項AC的偏回歸系數顯著,說明NaCl濃度和液固比的交互項對羥基自由基清除率有顯著影響;2個二次項A2、B2的偏回歸系數達到極顯著水平,說明NaCl濃度和液固比對羥基自由基清除率影響極大,且不是簡單的一次線性關系。

表3 回歸方程方差分析表Table 3 Analysis results of regression and variance

注:“*”為顯著(p<0.05),“**”為極顯著(p<0.01)。

2.2.4 響應面曲面分析 通過響應曲面圖,可直觀地看出各個因素間的交互作用及其對羥基自由基清除率的影響。等高線的形狀越接近橢圓形,說明因素間的交互作用越強,說明其交互效應越顯著[16]。由于交互項里只有NaCl濃度和液固比的交互作用顯著,因此做出該交互項的響應面圖和等高線圖(圖5)。由圖5的響應曲面可以看出,羥基自由基清除率受到NaCl濃度和液固比的影響,只有取中間某個值時,清除率才能達到最大值。另外可以看出,NaCl濃度和液固比的交互作用顯著,等高線的中心點即為兩者組合的最優值。

圖5 NaCl濃度和液固比的交互作用對羥基自由基清除率影響的響應曲面和等高線Fig.5 Response surface and contour plots for the influence of NaCl concentration and liquid-solid rate on the clearance rate of hydroxyl radical

2.2.5 驗證實驗 對實驗模型進行分析,得到制備瘤背石磺活性多肽的最優工藝條件為:NaCl濃度0.09%,液固比56.71 mL/g,提取時間2.23 h,此條件下羥基自由基清除率最大,為33.11%。進行驗證實驗時,考慮到操作的可行性,將條件改為:NaCl濃度0.09%,液固比57 mL/g,提取時間2.5 h,實際測得羥基自由基清除率為33.41%、33.29%、33.21%、33.47%和33.32%,平均值為33.34%,與理論預測值33.11%相接近且相對誤差只有0.7%,說明采用響應面法優化得到的工藝條件比較可靠,具有一定的參考價值。

2.3瘤背石磺活性多肽抗氧化作用

2.3.1 活性多肽對羥基自由基的清除活性 羥基自由基是體內活性氧自由基中活性最強的,容易與諸如蛋白質,氨基酸等生物分子反應,因此清除羥基自由基是預防疾病的一種有效方法[17]。從圖6可以看出,在濃度低于2.0 mg/mL時,瘤背石磺活性多肽對羥基自由基清除率略微高于肌肽,但當濃度高于2.0 mg/mL后,肌肽對羥基自由基的清除率明顯高于瘤背石磺活性多肽,表明瘤背石磺天然活性多肽具有一定的羥基自由基清除能力。

圖6 活性多肽對羥基自由基的清除效果Fig.6 Hydroxyl radical clearance ability of bioactive peptides

2.3.2 活性多肽對DPPH自由基的清除活性 DPPH自由基溶于乙醇溶液時呈紫羅蘭色,并在517 nm處有最大吸光度。DPPH自由基的孤對電子與物質結合,吸光度降低。吸光度越低說明物質清除DPPH自由基的能力越強[18]。從圖7可知,瘤背石磺活性多肽對DPPH自由基的清除作用明顯比肌肽要高很多。在濃度為3 mg/mL時,瘤背石磺活性多肽對DPPH自由基的清除率就已經是肌肽的2倍多,表明瘤背石磺活性多肽具有較強的DPPH自由基清除能力,是一種有效的DPPH清除劑。

圖7 活性多肽對DPPH自由基的清除效果Fig.7 DPPH radical clearance ability of bioactive peptides

2.3.3 活性多肽對H2O2的清除活性 由圖8可知,肌肽對H2O2有著很強的清除能力,在0.2 mg/mL的濃度時就已達到將近90%的清除率,高于瘤背石磺活性多肽。但隨著濃度增大,瘤背石磺活性多肽與肌肽的差距逐漸縮小。在濃度為0.8 mg/mL時,能達到60%,表明其對H2O2有較強的清除能力。

圖8 活性多肽對H2O2的清除效果Fig.8 Hydrogen peroxide clearance ability of bioactive peptides

2.3.4 活性多肽的還原能力 還原能力與抗氧化能力呈正相關,還原能力強的樣品能通過提供電子與自由基反應,使自由基形成較為穩定的物質來中斷自由基連鎖反應[19]。吸光度越大,說明還原能力越強。由圖9可以看出,肌肽的還原能力較低,相比之下,瘤背石磺活性多肽的還原能力明顯高于肌肽,表明瘤背石磺活性多肽具有較強的還原能力。

圖9 活性多肽的還原能力Fig.9 Reducing power of bioactive peptides

2.3.5 活性多肽的亞鐵離子螯合能力 亞鐵離子等金屬離子能催化脂質的氧化,因此一種物質如果具有金屬離子螯合能力,則能起到抗氧化作用。由圖10可以看出,濃度從1 mg/mL增大到2 mg/mL時,肌肽的亞鐵離子螯合能力迅速增強,而后趨于平穩。瘤背石磺活性多肽的亞鐵離子螯合能力相比肌肽較弱,但在濃度為4 mg/mL時仍能達到50%左右,說明其具有一定的亞鐵離子螯合能力。

圖10 活性多肽的亞鐵離子螯合能力Fig.10 Ferrous ion chelating capacity of bioactive peptides

3 結論

響應面法對瘤背石磺活性多肽制備工藝的優化結果為:NaCl濃度0.09%,液固比57 mL/g,提取時間2.5 h,在此條件下羥基自由基清除率平均值為33.34%,與預測值33.09%相接近且相對誤差只有0.76%,證明優化結果合理可行。體外抗氧化實驗結果表明,瘤背石磺活性多肽對羥基自由基、DPPH自由基、H2O2有較好清除能力,還具有一定還原能力以及亞鐵離子螯合能力。總體而言,瘤背石磺活性多肽表現出較好的體外抗氧化活性,具有良好的開發前景。

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StudyonprocessoptimizationandantioxidantactivityofbioactivepeptidesfromOnchidiumstruma

LIBo-hang,SHENHe-ding*,ZHUMin,ZHAOYong-can

(Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources, Minister of Education,Shanghai Ocean University,Shanghai 210306,China)

In this paper,the preparation process of oyster bioactive peptides was optimized by response surface method. The effect of NaCl concentration,liquid-solid ratio,temperature and extraction time on the scavenging rate of hydroxyl radicals was investigated. The result showed that optimum extraction conditions were:NaCl concentration 0.09%,liquid-solid rate 57 mL/g,time 2.5 h. Under this condition,the predictive value clearance rate of hydroxyl radical was 33.09% and the measured value was 33.34%,and the relative error was only 0.76%. It showed that the optimum extracting condition of response surface method was reasonable and feasible. The best result of bioactive peptides antioxidant activity indicated that it had a relatively good scavenging ability to hydroxyl radical,DPPH free radical and H2O2. Meanwhile,it also had reducing power and ferrous ion chelating capacity. On the whole,Onchidiumstrumabioactive peptides reflect a certain antioxidant activity and has a good prospect of development.

Onchidiumstruma;response surface methodology;bioactive peptides;antioxidant activity

2017-02-21

李柏航(1990-)，男，碩士研究生，研究方向：海洋生物資源研究與開發，E-mail:li_bo_hang@sina.com。

*通訊作者:沈和定(1964-)，男，博士，教授，研究方向：貝類增養殖及海洋生物資源利用，E-mail:hdshen@shou.edu.cn。

國家自然科學基金項目(41276157)；上海高校水產學一流學科建設項目資助。

TS201.2

:B

:1002-0306(2017)15-0168-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.15.032