鈍裂銀蓮花居群遺傳多樣性及其與生態因子相關性

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(蘭州理工大學生命科學與工程學院,甘肅蘭州 730050)

鈍裂銀蓮花居群遺傳多樣性及其與生態因子相關性

劉志鵬,劉左軍*,楊利云,徐文

(蘭州理工大學生命科學與工程學院,甘肅蘭州 730050)

采用RAPD技術分析了4個地區(合作、碌曲、瑪曲、阿孜)不同花色(黃、淺、白)11個鈍裂銀蓮花居群的遺傳結構。結果表明:鈍裂銀蓮花居群遺傳多樣性較高,Shannon多樣性指數(I)為0.6025,Nei’s基因多樣性指數(H)為0.4166,Nei’s基因分化系數(Gst)和AMOVA分析表明鈍裂銀蓮花居群間分化程度較低,大部分變異存在于居群內(67%),居群間占一小部分(33%)。對不同居群進行UPGMA聚類分析,結果顯示11個亞居群可以歸為3大支。相關性分析表明遺傳多樣性與地理分布和土壤營養狀況有相關性。

RAPD,鈍裂銀蓮花,遺傳多樣性,生態因子

鈍裂銀蓮花(Anemoneobtusiloba)為毛茛科(Ranunculaceae)毛茛亞科銀蓮花屬(AnemoneL.)的一種,是多年生蟲媒兩性花的自交親和植物,其花部結構泛化,一般由蜜蜂和蠅類進行傳粉,偶見螞蟻訪花[1],常見花色有黃、淺和白三種,也有處于三種花色之間的過渡色[2]。鈍裂銀蓮花主要分布于喜馬拉雅山區和青藏高原東緣地區,在我國則生長于西藏南部和東部、甘肅南部和四川西北部[3]。鈍裂銀蓮花是高寒草甸一種常見的毒雜草,不能被牛羊所食用,是造成高寒草場退化的物種之一[4]。目前,對鈍裂銀蓮花的研究主要集中在化學成分[5]、藥用價值[6]、傳粉[7]、化感[8]、性分配和繁殖分配[9-10]等方面,未見有從DNA分子水平來探究鈍裂銀蓮花如何在特定生態環境中與其他復雜的環境因子相互作用而形成現有的生物學特性和分布格局的報道。本文以RAPD技術從DNA分子水平分析鈍裂銀蓮花居群遺傳多樣性特征,豐富鈍裂銀蓮花分子生態學研究,并與其宏觀生態學特征相聯系,為進一步了解鈍裂銀蓮花花色維持、進化機制和防治高寒草場退化提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

鈍裂銀蓮花 2015年6月于甘肅省甘南藏族自治州合作、碌曲、瑪曲和阿孜4個地區采集不同花色居群的11個鈍裂銀蓮花材料,每種花色居群選25株鈍裂銀蓮花干凈健康無病蟲害的葉片,將葉子放入信封中,帶回實驗室干燥處理后將其封裝于裝有硅膠干燥劑的密封袋中,然后于-20 ℃冰箱中冷凍保存,供提取基因組DNA;RAPD隨機引物 購自Sangong公司。

Cary5000紫外可見分光光度計 Varian;TGL-16B高速離心機 上海安亭科學儀器廠;ModelMG96+DNA擴增儀 杭州郎基科學儀器有限公司;DYCP-31DN電泳儀 北京六一儀器廠;10,100,200,1000 μL 上海大龍;BCD-206Y冰箱 青島海爾有限公司;YX-24LD蒸汽滅菌鍋 科創化玻儀器中心;HH-S數顯恒溫水浴鍋 江蘇金壇市醫療儀器廠;AB104-N 分析天平 梅特勒儀器有限公司。

表1 鈍裂銀蓮花居群生態特征變量Table 1 Ecological variables in A. obtusiloba population

注:同行不同字母表示顯著性差異(p<0.05)。

1.2實驗方法

1.2.1 樣地生態因子測定 實驗樣地位于甘肅省甘南藏族自治州(101～103°E,34～35°70′N),年均降水量450～780 mm,降雨主要分布7～9月;年平均氣溫為1.8 ℃,七月份平均溫度11.7 ℃,生長季最高氣溫23.6～28.9 ℃年平均霜期不少于270 d。草地類型主要以高寒草甸為主,其高寒草甸有地勢開闊、多風,氣候寒冷等特點。主要的伴生種有:小嵩草(Kobresiapygmaea)、垂穗披堿草(Elymusnutans)、早熟禾(Poaannua)、異針茅(Stipaaliena)、短穗兔耳草(Lagotisbrachystachya)、美麗鳳毛菊(Saussureasuperba)、三裂葉堿毛茛(Halerpestestricuspis)等主要牧草[11]。

取地表0～10 cm土樣,按照《土壤農化分析手冊》[12]對土壤水分、pH、有機質、速效磷、速效氮、速效鉀和全磷進行測定,結果見表1。

1.2.2 DNA提取 采用改進的CTAB方法(即用氯仿-異戊醇抽提之前加用苯酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)抽提一次)提取基因組DNA,通過測定紫外吸收值確定DNA樣品的濃度和純度,通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA樣品的完整性,合格的DNA樣品在-20 ℃的低溫冰箱中保存備用。

1.2.3 引物篩選與PCR擴增 隨機選取2個樣品基因組DNA作為擴增模板,從100個RAPD隨機引物中篩選出擴增條帶清晰、多態性較高和重復性較好的14條引物(表2)。RAPD-PCR反應是在Model MG96+PCR擴增儀上進行的,最優擴增條件為:總體系為20 μL,10×buffer 2 μL,模板DNA 30 ng,引物0.4 mmol·L-1,Taq DNA酶0.5 U,dNTPs 0.4 mmol·L-1,Mg2+2.5 mmol·L-1,補滅菌ddH2O至20 μL;擴增程序為:96 ℃預變性5 min 30 s,94 ℃變性1 min 10 s,37 ℃退火1 min 40 s,72 ℃延伸1 min 10 s,共40個循環,最后72 ℃續補6 min 30 s。擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳分離,4S Red核酸染液染色后拍照記錄。

1.3數據分析

1.3.1 條帶計數 根據各分子標記的遷移率及其有無統計得出所有位點的二元數據:能重復出現且穩定清晰的RAPD條帶(陽性)記為1,不出現的條帶(陰性)記為0,強帶、弱帶的均賦值為1,統計得到所有位點的二元數據,由此形成的RAPD表型數據矩陣用于進一步分析。

1.3.2 鈍裂銀蓮花居群遺傳特征分析 用POPGENE 1.32軟件在假定居群處于Hardy-Weinberg平衡狀態[13]下,計算多態位點百分率(PPL)、Nei’ s基因多樣性指數(He)、Shannon 信息指數(I)、居群間的遺傳分化系數(Gst)、Nei’ s遺傳距離(GD)和遺傳一致度(GI)[14]。用AMOVA(Analysis of molecular variation)分析居群遺傳變異[15]。用NTsys 2.10e軟件基于Nei’ s遺傳一致度(GI),采用UPGMA(Unweighted pair group method using arithmetic averages,非加權配對算術平均法)對11個鈍裂銀蓮花居群聚類分析,得到遺傳相似系數聚類圖[16]。

1.3.3 鈍裂銀蓮花居群遺傳特征與生態因子相關性測定 采用SPSS 20對鈍裂銀蓮花居群遺傳多樣性和遺傳距離與各生態因子進行相關性分析,并做主成分分析(Principal component analysis,PCA)。

2 結果與分析

2.1引物序列及擴增結果

對4個地域11個不同顏色居群共220個個體進行擴增,共得到792條帶,只有一個位點不具備多態性,總多態性比率為98.61%;每條引物的多態位點數2～7不等,其多態位點比率在0.667～0.989之間,其中引物S5對碌曲淺色居群(LQS)20個個體擴增結果見圖1。

表2 實驗所用RAPD引物及其序列Table 2 RAPD primers used in the analysis

圖1 引物S5對碌曲淺色居群擴增結果Fig.1 RAPD-PCR results of population LQS with Primer S5

2.2鈍裂銀蓮花的遺傳多樣性

鈍裂銀蓮花居群內的多態位點率從77.78%到98.73%不等,平均為95.44%,每個位點平均有效等位基因為1.7435。Nei’s基因多樣性在居群水平上處于0.3153～0.3799之間,在物種水平上是0.4166;Shannon信息指數在居群水平處于0.4611～0.5568之間,在物種水平上是0.6025。在各居群之間,瑪曲淺色(MQS)居群的多態位點比率(PPL)最高,瑪曲白色(MQW)居群的最低,各居群的多態性比率順序為:MQS>HZS>MQY>AZY>AZS>LQY>LQW>LQS>HZW>HZY>MQW(見表3)。

表3 鈍裂銀蓮花居群遺傳多樣性分析統計Table 3 Summary of genetic variation statistics of populations of A.obtusiloba

注：HZY:合作黃色;HZS:合作淺色;HZW:合作白色;LQY:碌曲黃色;LQS:碌曲淺色;LQW:碌曲白色;MQY:瑪曲黃色;MQS:瑪曲淺色;MQW:瑪曲白色;AZY:阿孜黃色;AZS:阿孜淺色;表6同。

2.3鈍裂銀蓮花的遺傳結構分析

根據popgene1.32軟件計算得知,11個鈍裂銀蓮花居群間的遺傳分化指數(Gst)為0.1795,總居群基因多樣度(Ht)為0.4166,居群內基因多樣度(Hs)為0.34184,基因流(Nm)每代居群間平均為2.2863(見表4)。由此可以得出:居群間遺傳變異占總變異的17.95%,居群內的個體間遺傳變異占82.08%。進一步用Genalex中AMOVA分析得出,居群間變異百分率為33%,居群內變異百分率為67%。結果基本與POPGNEN 1.32軟件分析結果一致(見表5)。

遺傳距離和一致度是從不同角度表征居群(或個體)間的遺傳變異水平。經分析得知,鈍裂銀蓮花居群間遺傳一致度的變化范圍為0.6154～0.9583,平均遺傳一致度為0.7339;居群間遺傳距離(GD)從0.0417～0.3549不等,平均遺傳距離為0.2661。合作淺色(HZS)亞居群與阿孜黃色(AZY)亞居群間的遺傳距離最大,為0.3549;合作黃色(HZY)亞居群與合作淺色(HZS)亞居群間的遺傳距離最小,為0.0417(見表6)。

基于Nei’s無偏距離分析的鈍裂銀蓮花各居群的遺傳一致度,利用NTsys(ver. 2.10e)中UPGMA模塊對11個亞居群間遺傳關系進行聚類分析(如圖2),以遺傳一致度0.78為基準,11個亞居群可以歸為3大支,第一支是合作鈍裂銀蓮花;第二支是碌曲黃、淺和白色居群,瑪曲黃色和淺色居群;第三支是阿孜黃、淺色居群和瑪曲白色居群。

表4 鈍裂銀蓮花居群遺傳分化Table 4 Genetic differentiation of populations of A.obtusiloba

表5 鈍裂銀蓮花居群AMOVA分析Table 5 Analysis of molecular variance for populations of A.obtusiloba

表6 鈍裂銀蓮花亞居群間遺傳一致度(對角線下方)和遺傳距離(對角線上方)Table 6 Nei’s unbiased measures of genetic identity and genetic distance

圖2 鈍裂銀蓮花居群聚類圖Fig.2 Dendrogram of 11 subpopulations of A.obtusiloba

2.4鈍裂銀蓮花居群遺傳特征與生態因子的相關性

2.4.1 主成分分析(PCA) 在圖3中,X軸代表第一主分量,反映的是鈍裂銀蓮花居群遺傳變異隨經度變化特征;Y軸表示第二分量,反映的鈍裂銀蓮花居群遺傳變異隨緯度變化特征;Z軸是第三分量,反映的鈍裂銀蓮花居群遺傳變異隨海拔變化特征。以上均表明鈍裂銀蓮花居群遺傳變異都與距離相關。圖中表明,合作黃色(HZY)、淺黃色(HZS)居群構成一個分布區;合作白色(HZW)、碌曲黃色(LQY)和碌曲淺色(LQS)居群構成一個分布區;碌曲白色(LQW)、瑪曲黃色(MQY)和瑪曲淺色(MQS)居群構成一個分布區;阿孜黃色(AZY)、阿孜淺色(AZS)和瑪曲白色(MQW)居群構成一個分布區。這與UPGMA計算結果和實際地理分布都比較符合。

2.4.2 遺傳多樣性、遺傳距離與生態因子相關性 將鈍裂銀蓮花居群遺傳多樣性、遺傳距離與生態因子進行相關性分析,結果表明(見表7):鈍裂銀蓮花的多態位點比率(PPL)、Shannon信息指數(I)與海拔、土壤有機質和速效氮(AN)含量呈極顯著負相關(p<0.01),與速效磷(AP)和全磷(P)呈顯著負相關(p<0.05);Nei’s基因多樣性指數(H)與土壤有機質和速效氮(AN)含量呈極顯著負相關,與海拔、全磷(P)呈顯著負相關(p<0.05),與緯度呈顯著正相關(p<0.05)。這說明海拔越低,土壤營養成分含量越低,鈍裂銀蓮花居群遺傳多樣性越高。遺傳距離(GD)與海拔呈極顯著正相關(p<0.01),與土壤含水量、速效氮(AN)呈顯著正相關(p<0.05)。

表7 遺傳多樣性、遺傳距離與生態因子相關系數Table 7 The correlation coefficients among genetic diversity, distance and ecological factors

注:*:p<0.05;**:p<0.01。

3 結論與討論

植物的遺傳多樣性是生物本身的遺傳信息與特定生態環境中生物、非生物的環境因子相互作用的結果,是生物基因組與復雜的生態環境相互作用的綜合表現[17]。本研究表明:裂銀蓮花居群內的多態位點率從77.78%到98.73%不等,平均為95.44%,與其他植物相比具有較高的遺傳多樣性。如陽翠等[18]利用RAPD技術分析了野生苦豆子(Sophoraalopecuroides)22個居群的遺傳多樣性,得出多態性比率為90.76%;付薇等[19]對馬蹄金(Dichondrarepens)種子資源遺傳多樣性的研究得出多態性比率為91.45%。11個居群多態性比率與Shannon信息指數和Nei’s基因多樣性指數分析結果基本一致。

遺傳變異主要是由選擇、突變和基因流等因素產生,空間距離在一定程度上也能夠使居群間產生遺傳變異和分化[20]。POPGENE1.32和AMVOA計算結果都表明鈍裂銀蓮花的遺傳變異主要發生在居群內,居群間的遺傳變異占一小部分,這與孫濤等[21]利用ISSR技術分析鈍裂銀蓮花遺傳變異結果相符合,也與鈍裂銀蓮花屬于自交親和植物這一事實相符。由于存在地理隔離,鈍裂銀蓮花居群間已經發生了較高的遺傳分化。UPGMA聚類分析和主成分分析的結果說明了這一點。植物遺傳變異不一定大部分發生在居群內,如司慶文等[23]用RAPD技術對青藏高原入侵雜草黃帚橐吾(Ligulariavirgaurea)的遺傳變異的研究結果表明67.64%的遺傳變異發生在黃帚橐吾種群間,31.74%遺傳變異存在種群內。

鈍裂銀蓮花居群間遺傳多樣性和遺傳變異與環境因素相關。海拔越低,土壤營養成分含量越低,鈍裂銀蓮花居群遺傳多樣性越高;土壤含水量、速效氮(AN)含量在鈍裂銀蓮花的地理分布中可能起著一定的作用,鈍裂銀蓮花居群遺傳距離與地理隔離有很大關系。這可能是鈍裂銀蓮花適應復雜殘酷青藏高原環境的結果。

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GeneticdiversityinAnemoneobtusilobapopulationsanditsrelationshipwithecologicalfactors

LIUZhi-peng,LIUZuo-jun*,YANGLi-yun,XUWen

(School of Life Science and Engineering,Lanzhou University of Technology,Lanzhou 730050,China)

The genetic structure of 11 different populations of floral-colorAnemoneobtusilobain 4 different areas of Gannan were evaluated using random amplified polymorphism DNA(RAPD). The results showed that the genetic diversity inAnemoneobtusilobapopulations was quite high:The Shannon index(I)was 0.6025 and Nei’s gene diversity(H)was 0.4166. Moreover,the differentiation level among populations was low based on Nei’s Gst value and analysis of molecular variance(AMOVA). Less than 33% of genetic diversity was attributed to the differentiation among populations while more than 67% resided within the different populations. According to unweighted pair group method using arithmetic averages(UPGMA)result,11 populations ofA.obtusilobawere clustered into 3 groups. Further correlation analysis showed that genetic diversity and distance correlated with geographical distribution and soil nutrition.

RAPD;Anemoneobtusiloba;genetic diversity;ecological factors

2017-04-14

劉志鵬(1991-)，男，在讀碩士研究生，主要從事分子生態學研究，E-mail:liuzhipengzmj@foxmail.com。

*通訊作者:劉左軍(1957-)，男，博士，教授，主要從事植物種群生態學研究，E-mail:zuojunl@lut.cn。

國家自然科學基金(30960066)。

TS201.3

:A

:1002-0306(2017)17-0141-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.17.028