轉基因作物代謝組差異的協同性分析

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(1.中國檢驗檢疫科學研究院,北京 100029;2.廣西出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心,廣西南寧 530021;3.海南出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心,海南海口 570311)

轉基因作物代謝組差異的協同性分析

許文杰1,杜智欣2,張亮亮3,付偉1,*

(1.中國檢驗檢疫科學研究院,北京 100029;2.廣西出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心,廣西南寧 530021;3.海南出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心,海南海口 570311)

轉基因技術的應用十分廣泛,尤其是用于獲得具備優良性狀的農作物新品種。但在轉基因作物商業化推廣的同時,農產品的安全問題一直備受關注。組學技術的不斷發展,為轉基因作物的安全評價提供了新方法。鑒于代謝組數據具有即時性和可獲得性的特點,本文基于之前的研究,通過收集轉基因作物代謝組方面文章的數據,對6種作物的野生型和轉基因型樣本的比較結果進行整合分析,通過顯著性檢驗得到了8種代表性差異代謝物。代謝通路富集分析結果顯示與這8種差異代謝物關聯的蛋白質主要參與能量代謝過程,與已報道的單一物種轉基因非預期效應的研究結果相同。該研究從代謝物和蛋白質兩個方面說明轉基因事件影響了這6種作物的能量代謝過程,并且該現象很可能普遍存在于多種轉基因作物中。希望本研究結果可以為轉基因農作物的安全評價提供參考。

轉基因作物,安全評價,代謝組學,差異代謝物,能量代謝

轉基因是指利用基因工程原理,將決定優良性狀的外源片段導入目標動植物體內,DNA進行重組,從而獲得抗病、耐寒、耐旱、高產和高營養價值等優質品種的過程。在轉基因應用中以轉基因植物最為普遍,自從美國1996年將轉基因延熟番茄批準進入市場,并成為第一個將轉基因作物商品化進入市場的國家后,多種轉基因作物相繼培育成功并獲得批準進入市場[1]。2016年是轉基因作物商業化21周年,全球轉基因作物累計種植面積達到空前的21億公頃,轉基因作物由玉米、大豆、棉花和油菜擴展到甜菜、木瓜、茄子和馬鈴薯。種植轉基因作物的國家已達到26個,包括19個發展中國家和7個發達國家,中國作為發展中國家不僅在轉基因作物種植面積排名前10[2],而且是轉基因產品進口大國。轉基因作物在解決溫飽問題的同時,也為農民乃至為全社會帶來了巨大的農業、環境、經濟、健康和社會效益。

轉基因作物是通過人為操作獲得的,并不是自然進化而來。由于外源基因的插入具有隨機性,轉基因樣本與親本在表型、反應和組成上會存在一定的統計學差異[3],可能包括一些非預期效應,所以在大力推廣轉基因產品的同時,其安全性問題也一直是爭議的焦點。世界上不同的國家對轉基因產品有不同的管理和標識,并且國際上公認的識別轉基因非預期變化的技術都是基于實質等同(substantial equivalence)原則[4]。近年來,由于生物技術的不斷創新,轉錄組、蛋白質組和代謝組等組學技術迅速發展,應用組學數據從多水平分析轉基因產品的安全性問題也日益成為熱點。但大量的組學數據研究結果表明,在實驗同質性較差的情況下,許多研究并沒有呈現出相同的結果。除外源基因的插入外,環境、遺傳背景和實驗技術等因素都會對植物的生長產生影響[5]。截止到目前,通過單一組學研究也未能找出一條完整的與表型變化相關的受調控通路[6-7],所以綜合多方面了解轉基因作物的整體變化情況是十分必要的。

三種組學技術都具有各自的優勢:轉錄組學可以測定生物體、組織或細胞在特定條件下的表達基因,并且對其進行定量;蛋白質組學是從整體水平來研究蛋白質的結構和功能,包括蛋白質的表達、修飾和相互作用等;代謝組學能夠定量描述生物內源性代謝物質的整體及其對內因和外因變化的應答規律[8],數據具有即時性,更能直接反映出轉基因產品對食用對象的影響,相對于已有的轉錄組和蛋白質組研究,代謝組數據的可獲得性更強。許多轉基因產品的安全性評價都是通過代謝物數據分析完成的,其測定技術也在逐漸完善,主要包括核磁共振法(Nuclear Magnetic Resonance,NMR)[9]和氣相色譜-質譜聯用技術(Gas Chromatography-Mass Spectrometry,GC-MS)[10]等。但絕大多數未公布代謝物的原始測定數據,只是列出了差異分析的結果。為了能夠充分利用現有數據,并避免單一組學研究的局限性[11],是通過檢索大量的轉基因代謝物文章,對多種轉基因作物的差異代謝物進行綜合分析,挖掘出比較具有代表性的差異代謝物,并通過追溯到其蛋白質水平,從兩方面揭示了轉基因事件對這6種作物的影響,希望為轉基因產品的安全性評價提供參考。

1 材料與方法

1.1文獻檢索及篩選

本文的目的是通過代謝組數據分析來研究轉基因事件對農作物的生理影響,僅以“transgene(轉基因)”、“metabolite(代謝物)”、“plant(植物)”或者“crop(農作物)”為關鍵詞對PubMed、Science Direct和Elsevier等數據庫對已發表文章進行檢索,時間范圍為2004～2016年。

根據關鍵詞檢索的文獻涉及到多個物種,并且轉基因體系和數據格式也不完全相同。選取其中具有完整的差異代謝物列表,或者是轉基因與親本代謝物中間數據的文獻作為后續分析使用。

1.2數據收集及處理

文獻檢索及篩選完成后,提取其中的代謝物數據,由于數據來源于多項研究,需要統一代謝物名稱,并忽略了構型信息。數據共包括差異代謝物、樣本代謝物的平均值和標準差兩種類型。前者可以直接使用,后者因為只有中間數據,無法直接獲得差異代謝物,需要編寫SAS腳本計算代謝物的差異顯著性。首先對轉基因樣本和親本的代謝物進行方差齊性檢驗-F檢驗(公式1),如果兩樣本的方差相等,按照公式2進行t檢驗,反之,按照公式3進行t檢驗,得到差異代謝物。

式(1)

式(2)

式(3)

式中S1和S2分別為轉基因品系和親本的代謝物標準差;x1和x2分別為轉基因品系和親本的代謝物測定平均值;n1和n2分別為轉基因品系和親本的樣本數。

在符合分析要求的文獻中,一部分數據包含了多個轉基因品系與親本之間的比較,將其按照轉基因品系拆分為多個數據集,最后排除差異代謝物少于3個的樣本數據,按照平行數據進行后續分析。

1.3差異代謝物分析

將得到的差異代謝物數據集按照所有品種、玉米和水稻三類分別進行合并,并進行二分類標記:如果在數據集A中包含代謝物a,則標記為1,反之標記為0(表1)。得到數據集后,使用SAS9.2的ttest程序進行單樣本單邊t檢驗。因為綜合數據集涉及多個物種,所以降低了顯著性檢驗的條件,假設h0=0.5,按照p>0.05為標準篩選差異代謝物作為較具有代表性的差異代謝物,即在所有數據集中平均出現次數不顯著小于0.5次的差異代謝物。而玉米和水稻物種則假設h0=1,以p>0.01為標準提取具有代表性的差異代謝物。

表1 差異代謝物的部分合并結果Table 1 The partial merged result of differential metabolites

首先,使用MBROLE 2.0[12]網站對所有物種篩選得到的代表性差異代謝物進行KEGG通路富集分析,得到其參與的主要代謝過程。然后又通過STITCH 5.0[13]網站分別對所有物種、玉米和水稻的代表性差異代謝物進行代謝物和蛋白質的關聯網絡及蛋白質的代謝通路富集分析,從代謝物和蛋白質兩個方面揭示整個轉基因事件對農產品影響的同時,檢測物種偏好性是否會對結果產生影響。其中第二層節點設置為最多不超過10個,其余參數均為默認值。

2 結果與分析

2.1文獻檢索及篩選結果

根據文獻檢索策略,從多個數據庫中共得到56篇相關文獻,篩選其中具有完整的差異代謝物列表,或者是轉基因與親本代謝物中間數據的文獻,最后得到符合條件的文獻共20篇,包括玉米、水稻、大豆、馬鈴薯、番茄、小麥和油菜7個物種,且各物種的樣本數均不相同,其中玉米和水稻數據較多(表2)。

2.2數據收集及處理結果

從符合篩選條件的文獻中提取不同轉基因品系的代謝數據,根據公式對少數的中間數據進行獨立樣本t檢驗計算差異代謝物,統一數據格式。排除差異代謝物少于3個的數據集,最后分別減少了一個小麥和大豆樣本,即從玉米[6,14-17]、水稻[18-22]、大豆[23-25]、馬鈴薯[26]、番茄[27,28]和油菜[29]的6個物種的18篇文章中提取出了26個數據集(表2)。

表2 文獻檢索及數據收集匯總Table 2 Summary of the literature screening and data collection

注:每個物種的文章數目表示為a+b,其中a為最終被納入分析的文章數目,b為差異代謝物少于3 個的文章數目;數據集是指每個物種用于后續分析的樣本數據數目,“-”代表無可納入數據集。

2.3多物種的差異代謝物分析結果

合并所有數據,得到一個綜合數據集,整理并去冗余后得到129個差異代謝物,使用SAS9.2軟件對其進行單樣本單邊t檢驗分析。因為數據來自于多項不同的研究,存在一定程度的異質性,按照材料與方法中的統計標準篩選代表性差異代謝物,最后得到了8種代表性差異代謝物(表3)。結果說明代謝物的表達具有不穩定性,這可能是由于外界因素的變化或是異質性條件所造成的。同時這也從側面證明,得到的8種差異代謝物確實具有一定的代表性。

表3 差異代謝物分析結果Table 3 The ttest analysis result of differences in metabolites

注:“√”指該差異代謝物在該數據集中是代表性的差異代謝物。

通過MBROLE 2.0網站對6個物種篩選得到的8個差異代謝物進行KEGG代謝通路富集分析,以錯誤發現率(False Discovery Rate,FDR)為標準(FDR<0.05)篩選富集顯著的代謝通路,其中只有氰基氨基酸代謝通路符合條件(FDR=0.0056)。研究結果指出,該代謝過程與油菜種皮的顏色形成過程相關[30],并且從代謝通路圖可以看出,參與氰基氨基酸代謝的代謝物僅為酪氨酸和丙氨酸兩種,且均處于代謝通路的邊緣部分,起到銜接其他代謝過程的作用(圖1)。所以,并不能確定參與此代謝通路的差異代謝物的具體功能。其余6個差異代謝物并未涉及任何的代謝通路,可能是目前還尚未明確其具體功能,有待進一步的發現。

圖1 差異代謝物的氰酸代謝通路富集圖Fig.1 The figures of cyanoamino acid metabolism pathway for differential metabolites注:圖中圓圈指代謝物,方框指參與該過程的酶。圓圈即代謝物在通路中所處的位置。

圖2 6種作物的代表性差異代謝物和相關蛋白的網絡連接圖Fig.2 The network of the potentially representative differential metabolites and protein for six crops注:節點:橢圓代表代謝物,圓代表蛋白質;邊:代表代謝物和蛋白質的關系,線的粗細代表關聯性的強弱。

由以上結果可知,該代謝物的功能分析存在一定的局限性,而多數代謝物是由大分子物質消化水解得到的,所以又通過STITCH 5.0網站,追溯到代謝物上游的蛋白質層面,進行代謝物和蛋白質的關聯分析,并對相關蛋白質進行功能分析。網絡構建的結果表明,8種代謝物相互之間存在緊密聯系,其中丙氨酸和檸檬酸作為整個網絡的重要連接物質,都是重要的能量代謝中間物質。與代謝物相關的多個蛋白質間也存在較顯著的關聯性,可以更加明確的揭示相關代謝過程(圖2)。同樣以FDR<0.05為閾值進行蛋白質的代謝通路篩選,6個物種的分析結果顯示,代謝物關聯的蛋白質主要參與TCA循環、乙醛酸和二羧酸代謝和丙酮酸代謝等能量代謝過程[31-33](表4)。

表4 6種作物的代表性差異代謝物相關蛋白質的通路富集分析Table 4 The pathway enrichment result of proteins associated with the potentially representative differential metabolites in STITCH website for six crops

注:FDR指錯誤發現率,值越小,說明蛋白質在該代謝通路的富集結果越顯著。篩選標準為FDR<0.05。

上述結果與多項已發表的單一物種轉基因非預期效應的研究結果[18,34]一致,Liu等人通過比較轉基因與非轉基因水稻的基因表達情況,從轉錄水平解釋了轉基因事件對水稻的影響,發現差異表達基因主要參與能量代謝過程,并提出這可能是由于外源轉入的冗余標記基因引起了作物本身的應激反應所導致的,而應激反應需要更多的能量,從而表現在能量代謝方面的變化。Montero等人通過對轉基因樣本、相同處理的非轉基因樣本和野生型樣本基因表達情況的兩兩比較,得出轉基因過程以及體外培養條件都會對植株產生一定的損傷和刺激,從而引發一系列的應激反應,導致與能量代謝相關的基因發生了差異表達。

2.4玉米和水稻的差異代謝物分析結果

為避免物種偏好性對數據分析結果產生影響,對玉米和水稻的差異代謝物分別進行了分析。玉米和水稻的數據集合并且處理后分別得到了42個和46個差異代謝物,同樣對其進行單樣本單邊t檢驗,兩物種分別得到11個和3個代表性差異代謝物(表3)。同樣通過STITCH 5.0網站分析,得到兩物種的通路富集分析結果(表5)。通過結果比較可知,玉米和水稻與6個物種的分析結果有類似之處,都參與能量代謝過程,比如嘌呤代謝、乙醛酸和二羧酸代謝以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的代謝等,但是各自涉及的代謝通路并不完全相同,且相關基因數目也有所差異,說明所有物種的差異代謝物分析結果并不完全依賴于樣本數較多的玉米和水稻物種,不存在明顯的物種偏好性,該結果可以反映轉基因事件對這6種作物的普遍影響情況。

表5 玉米和水稻的代表性差異代謝物相關蛋白質的通路富集分析Table 5 The pathway enrichment result of proteins associated with the potentially representative differential metabolites in STITCH website for maize and rice

注:FDR指錯誤發現率,值越小,說明蛋白質在該代謝通路的富集結果越顯著。篩選標準為FDR<0.05。

3 結論

本文通過收集18篇已發表文章的轉基因差異代謝物數據,對6種作物的差異代謝物進行顯著性檢驗,得到了8種代表性差異代謝物,并在沒有明顯物種偏好性的前提下,結合關聯網絡分析,從代謝物和蛋白質兩方面對其進行了綜合分析,發現轉基因樣本與野生型樣本在能量代謝上存在顯著性差異。多項研究結果表明,轉基因事件會通過激發植物的應激反應來引起作物能量代謝過程的變化,本文的結果恰好是對此現象的進一步論證,并且揭示了轉基因事件對多種作物的能量代謝可能存在普遍影響的現象。除此之外,沒有發現其他顯著且普遍存在的轉基因非預期效應,希望該結果可以為轉基因產品在代謝物層面的安全性分析提供一定的參考價值。

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Cooperativeanalysisofthedifferencesinmetabolomeforgeneticallymodifiedcrops

XUWen-jie1,DUZhi-xin2,ZHANGLiang-liang3,FUWei1,*

(1.Chinese Academy of Inspection and Quarantine,Beijing 100029,China;2.Guangxi Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau Testing Center,Nanning 530021,China;3.Hainan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau Testing Center,Haikou 570311,China)

Transgenic technology is widely used,particularly for obtaining the high-quality crops. But in the commercialization of genetically modified crops,the safety of the products has been concerned. The continuous development of the omics has provided a new method for the safety evaluation of genetically modified crops. In view of the instantaneity and availability of metabolite data,the comparison results of metabolites for 6 crops between wild and transgenic samples were analyzed comprehensively,and the data were collected from many articles which had been reported in the metabolomics analysis of genetically modified crops. Eight differential metabolites were obtained with the representativeness based on the significant test,and the result of metabolic pathway enrichment showed that the proteins associated with them were involved in energy metabolism,which was same as the published result of the transgenic unintended effect study for single-species. The study revealed that transgenic event affected the energy metabolism of these six crops from both metabolites and proteins aspects,and the phenomenon may be prevalent in a variety of genetically modified crops. It is hoped to provide a reference for the safety evaluation of genetically modified crops.

genetically modified crops;safety evaluation;metabolomics;differential metabolite;energy metabolism

2017-03-10

許文杰(1990-)，女，博士研究生，研究方向：植物檢疫與入侵生物學，E-mail:xuwenjieee@163.com。

*通訊作者:付偉(1983-)，女，博士，副研究員，研究方向：轉基因生物安全，E-mail:fuwei0212@163.com。

轉基因產品抽制樣和精準檢測技術(2018ZX08012-001);廣西區內主要農作物及其制品轉基因精準檢測技術研究與應用(2016GXCIQ003)。

TS201.6

:A

:1002-0306(2017)17-0135-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.17.026