一株高產金屬硫蛋白枯草芽孢桿菌的誘導發酵條件優化

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(1.浙江海洋大學,浙江舟山 316022; 2.國家海洋局第三海洋研究所,福建廈門 361000; 3.福建省海洋生物資源開發利用協同創新中心,福建廈門 361000)

一株高產金屬硫蛋白枯草芽孢桿菌的誘導發酵條件優化

鄒俊杰1,2,3,張賓1,孫繼鵬2,3,*,閻光宇2,3

(1.浙江海洋大學,浙江舟山 316022; 2.國家海洋局第三海洋研究所,福建廈門 361000; 3.福建省海洋生物資源開發利用協同創新中心,福建廈門 361000)

金屬硫蛋白為一類廣泛存在于生物體內的多功能誘導性蛋白,具有轉運儲存金屬離子、清除自由基、激活(失活)鋅調節蛋白等功能,近年來已成為研究與開發的熱點。本文以一株基因重組枯草芽孢桿菌為實驗對象,對其誘導表達金屬硫蛋白發酵條件進行研究。結果表明,枯草芽孢桿菌最優生長條件為:培養溫度37 ℃,培養基初始pH7,搖床轉速220 r/min,接種量4%;最佳誘導發酵條件為:菌液OD600=3.9,IPTG終濃度1 mmol/L,搖床轉速220 r/min,誘導時間48 h,誘導金屬Cd2+終濃度為50 μmol/L,發酵培養基無機鹽為1% MgSO4、碳源為2%蔗糖、氮源為1.5%酵母浸出物+胰蛋白胨+氯化銨(2∶2∶1),枯草芽孢桿菌MT表達量達到最高為0.135 mg/mL。本研究為開發天然、高效海洋源金屬硫蛋白提供了一定理論依據。

金屬硫蛋白,枯草芽孢桿菌,發酵

金屬硫蛋白(metallothionein,MT)是一類低分子質量、高巰基含量、能結合金屬離子,尤其對Cd2+、Zn2+、Cu2+、Au+、Ag+等重金屬具有較強親和力的蛋白質,其廣泛存在于從細菌到哺乳動物的多種生物體內,具有金屬解毒、清除自由基、抗電離輻射、抗細胞凋亡、增強機體對抗不良狀態的適應能力等多種功能,因此在醫藥、環境檢測、保健品、化妝品等領域有廣闊的市場應用前景[1]。

目前,由于MT在生物體內具有十分重要的生物學功能,其應用范圍也越來越廣泛,開發與利用MT已成為熱點研究領域。自1957年Margoshes和Vallee[2]等報道從蓄積鎘的馬腎臟中分離出Cd-MT以來,研究發現幾乎能從所有哺乳動物、魚類、兩棲類和某些植物及真核、原核微生物中分離得到Cd-MT[3-4]。陸續有日本學者Naiki[5]等從釀酒酵母IFO 0044 RCU菌株中分離得到不含芳香族氨基酸的MT;Olafson[6]等在藍細菌中發現MT;Kneer[7]等發現粗糙脈孢菌能誘導類Cu-MT產生;吳傳松[8]篩選得到具有產金屬硫蛋白能力的酵母菌,并對培養條件進行優化,MT的產量由0.885 mg/g提高到了1.366 mg/g;成玉梁[9]通過對實驗室誘變處理得到的金屬硫蛋白高產且遺傳性狀穩定的釀酒酵母進行發酵誘導條件的優化,測得MT產量為0.074(以巰基活性計),較優化前大幅提高。盡管可以從各種動物器官、植物組織中分離提純MT,但從動植物體中提純MT仍存在著成本高、周期長等缺點。而利用微生物發酵培養,特別是依靠生物工程菌的培育來生產MT,因其具有無毒、來源可控、成本低廉、周期短等優點,必將受到市場開發的青睞。其中,路延篤[10]構建了猴金屬硫蛋白α域表達載體,并用其轉化大腸桿菌BL21(DE3),得到了產野生型猴金屬硫蛋白的工程菌,MT產率0.76 mg/g。呂品[11]以綠色熒光蛋白為報告基因,構建了金屬硫蛋白重組表達載體,并成功轉化出產金屬硫蛋白的畢赤酵母。蘇艷芳[12]采用乳酸乳球菌N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶AcmA的C端結構域作為融合標簽和錨定功能域,成功實現了人源Ⅰ型金屬硫蛋白在大腸桿菌體系的重組表達。

為解決制約MT產業發展原料來源瓶頸,本實驗室以海洋源貝類為原料,選擇安全的食品級微生物(益生菌)為表達宿主,通過構建MT表達載體,獲得益生菌重組菌株,MT初始產率為0.073 mg/mL。其中,枯草芽孢桿菌作為很有吸引力的外源基因表達的宿主,具有以下優點:遺傳學先進,生長迅速,培養條件簡單,大部分枯草芽孢桿菌可以形成自然感受態,攝取外源DNA;枯草芽孢桿菌具有強大的蛋白質分泌能力,外源蛋白在枯草芽孢桿菌中表達后,蛋白跨越細胞膜,被加工或直接釋放到培養基中而不發生聚集,回收和純化蛋白較為簡單;枯草芽孢桿菌分泌的蛋白質產品中不會混雜有胞被內毒素,被廣泛應用于傳統的食物,飲料發酵,食用防腐劑的生產;枯草芽孢桿菌是許多工業酶制劑的生產菌,因此具有良好的發酵基礎和生產技術。另外,食品安全級工程菌(益生菌)作為表達宿主,其生物毒性低、遺傳性狀穩定,且該菌株八種蛋白酶缺陷,能大幅降低蛋白酶對MT的分解作用。

本研究以WB-800枯草芽孢桿菌工程菌(本實驗室重組獲得)為研究對象,綜合考察其誘導表達金屬硫蛋白發酵條件,獲得MT高效表達最佳途徑,得到MT樣品,為開發天然、高效海洋源重金屬生物解毒劑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

菌種:WB-800枯草芽孢桿菌工程菌(由國家海洋局第三海洋研究所保藏)。

麥芽糖、蔗糖、葡萄糖、無水硫酸鎂、氯化鈉、氯化鋅、氯化鈣、氯化銨、氯化鎘、亞硒酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、乙腈、甲醇、氫氧化鉀、硼酸、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀等,以上試劑均為分析純 西隴化工股份有限公司。

Tris-(2-carboxylethyl)-phosphine(三(2-酰乙基)磷鹽酸鹽)、Ammnium 7-Fluoro-2,1,3-bzoxadiazole-4-sulfonate(SBD-F衍生劑)、兔肝金屬硫蛋白標準品(≥90%),Sigma-Aldrich上海貿易有限公司。

LB培養基、技術瓊脂粉、Glycerol(甘油)、Neomycin Sulfate(硫酸新霉素)、Chloramphenicol(氯霉素)、IPTG Dioxane Free(異丙基硫代半乳糖苷)等,以上試劑均為分析純 北京索萊寶科技有限公司。

平板培養基:酵母浸出物5 g/L,胰蛋白胨10 g/L,氯化鈉10 g/L,瓊脂粉15 g/L,自然pH。

LB培養基:酵母浸出物5 g/L,胰蛋白胨10 g/L,氯化鈉10 g/L,自然pH。

UV-1780紫外可見分光光度計 島津儀器有限公司;Waters e2695高效液相色譜儀 2475熒光檢測器,沃特世科技有限公司;QTY-70S恒溫搖床 上海知楚儀器有限公司;LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠等。

1.2菌種培育和優化

將-20 ℃保存菌種轉接到平板培養基,37 ℃活化24 h。取一環活化菌種,接入裝有50 mL LB培養基的200 mL三角燒瓶中,37 ℃,200 r/min育種20 h。取一定體積OD600=3.5的種子液,接入裝有50 mL LB培養基的200 mL三角燒瓶中,保持裝液量和37 ℃條件不變,分別優化培養基初始pH、搖床轉速和接種量對菌種培育影響。各影響因素設計如下:培養基初始pH:5.0、6.0、7.0、8.0、9.0;搖床轉速180、200、220、240 r/min;接種量1%、2%、4%、8%,每組設置三個平行實驗,每2 h取樣測定菌液OD600,確定最佳菌種培育條件。

1.3誘導發酵和優化

菌株在最佳條件下(培養基初始pH為7,培育轉速為220 r/min,接種量為4%)培養,分別加入一定體積的葡萄糖、IPTG誘導劑、ZnSO4、Na2SeO3、CdCl2,37 ℃下搖瓶誘導發酵。分別考察了菌液OD600、IPTG終濃度、搖床轉速、金屬添加量及誘導發酵時間對菌株表達MT影響。各影響因素設計如下:菌液OD6001.0、2.0、3.0、3.9;IPTG誘導劑量0、50、100、500、1000 μmol/L;搖床轉速180、200、220、240 r/min;誘導時間24、48、72 h;ZnSO4、Na2SeO3、CdCl2分別設立0、50、100、200、500、700 μmol/L,每組設置三個平行實驗,測定發酵液中MT含量,確定最佳誘導發酵條件。

同時對發酵培養基中2%碳源(甘油、麥芽糖、蔗糖、葡萄糖);1.5%氮源(牛肉浸出粉(一號)、酵母浸出物+胰蛋白胨+氯化銨(2∶2∶1)(二號)、酵母浸出物+胰蛋白胨+尿素(2∶2∶1)(三號)、酵母浸出物+胰蛋白胨(1∶1)(四號));1%無機鹽(硫酸鎂、磷酸氫二鈉+磷酸二氫鈉(1∶1)、空白、氯化鈉)分別進行考察,擇出最優發酵培養基條件。

1.4 MT測定方法

取20 μL MT上清液,依次加入3 μL 20%TCEP,10 μL 1 mg/mL SBD-F,75 μL反應緩沖液(1 mol/L硼酸、30 mmol/L EDTA、0.8 mol/L KOH,pH10.5)振蕩混勻,50 ℃水浴條件下反應30 min后,加入10 μL 4 mol/L HCl終止反應,用定容緩沖液(20 mmol/L K2HPO4、20 mmol/L KH2PO4,pH7.5)定容至1 mL,振蕩混勻,采用高效液相色譜法測定(流動相:乙腈∶甲醇∶定容緩沖鹽=18∶2∶80;色譜柱:伊利特ODS-BP C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);柱溫:35 ℃;洗脫時間:20 min;流速:0.5 mL/min;激發波長:380 nm,發射波長:510 nm)[13]。

1.5數據處理方法

精確量取兔肝MT標準品,逐級稀釋至0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 mg/mL,HPLC法測定后繪制標準曲線(方法同1.4),將所測樣品峰面積代入標準曲線,得到MT含量。

2 結果與討論

2.1菌種培育條件優化

2.1.1 初始pH對菌種培育的影響 在菌體培育過程中,因營養物質的消耗和菌體生長代謝所產生的分泌物,導致菌液pH上升或下降,此過程通常不可控,所以大多數發酵培養僅對培養基的初始pH進行優化調控。培養基的初始pH主要影響菌體細胞膜電荷、膜滲透性及營養物質離子化程度,合適的初始pH能顯著促進菌體對養分的分解與吸收。如圖1所示,在初始pH6～8范圍內,枯草芽孢桿菌的生長狀況良好,穩定期內菌體密度較大。初始pH為7時,菌體24 h內生長最為活躍,在24～36 h內的生長穩定期菌體密度大,宋文龍[18]等發現,培養基初始pH低于6.8或高于7.6均不利于枯草芽孢桿菌的生長,當pH為7.2時活菌數最高,與本實驗得出結論接近,故選初始pH7為培養基最佳初始pH。

圖1 初始pH對菌種培育的影響Fig.1 Effect of pH on cultivation of Bacillus subtilis

2.1.2 搖床轉速對菌種培育的影響 枯草芽孢桿菌為好氧性細菌,搖瓶中的氧氣量將直接影響細菌的生長和活性物質的產生。當裝液量一定時,搖床轉速為影響瓶內氧氣量的重要因素。如圖2所示,在180～240 r/min之間,隨著轉速的增加,菌體生長加快,但培養42 h后,220 r/min與240 r/min兩組的OD600較高,這可能是因為后期菌體密度增大,過低的搖床轉速已經不能滿足所有菌體的供氧需求。周映華[19]等對枯草芽孢桿菌生長設立搖床轉速:150、200、220、250、300 r/min,發現隨著轉速提高,OD600值升高,并在220 r/min時菌體密度達到峰值,與本文實驗結果相符。故選取220 r/min為最佳培養轉速。

圖2 搖床轉速對菌種培育的影響Fig.2 Effect of rotate speed on cultivation of Bacillus subtilis

2.1.3 接種量對菌種培育的影響 在發酵過程中,一般選取生長穩定期內的菌體用于后期誘導實驗,這樣既可保持高的細胞活力,又可獲得盡可能多的細胞數。如圖3所示,培養26 h時,接種量4%與8%組就已達到生長最高峰,而1%組別的生長最高峰出現在34 h。考慮到實際生產中的時間成本,故剔除1%與2%組別。對于8%組別,由于接種量過大,會造成菌體早衰,導致發酵后勁不足,張曉玲[20]等在利用枯草芽孢桿菌產胞外多糖的實驗中也認為,由于枯草芽孢桿菌屬好氧菌,當接種量過高時,導致氧氣量和底物量不足,影響其生長繼而影響次級代謝產物的表達,故本實驗選取4%為菌體培育最佳接種量。

圖3 接種量對菌種培育的影響Fig.3 Effect of inoculum rate on cultivation of Bacillus subtilis

2.2誘導發酵條件優化

圖4 轉速、誘導OD600、誘導時間和IPTG劑量對MT產量的影響Fig.4 Effect of rotate speed,OD600,Induction time,and IPTG on production of MT

2.2.1 誘導OD600、IPTG劑量、轉速和誘導時間 同2.1.2所述,發酵過程中的氧氣量決定了外源蛋白的表達量,如圖4所示,在200～240 r/min范圍內,MT的表達水平差距較小,為避免因過高的搖床轉速引起菌體機械損傷,故選220 r/min為最佳誘導搖床轉速。

誘導劑的加入觸發誘導菌體啟動子,菌體的生長受到抑制,合理選擇誘導劑加入的時間點,可使培養基中的營養得到合理消耗,從而提高目的產物的表達量。如圖4所示,隨著誘導OD600的增加,發酵液中MT的含量也隨之增加,這說明MT的表達量是與菌體密度成正相關,OD600=3.9時,正是菌體生長的最高峰,細胞活性高,菌體密度大,為此選取OD600=3.9為最佳誘導OD600。

如圖4所示,當發酵時間為48 h時,MT的表達量達到最高,繼續延長發酵時間MT的產量基本穩定,原因可能是當培養時間足夠長時,由于累積產物的自我抑制作用以及生長過程中產生的其他不利物質的影響和作用,導致菌體誘導培養過程中整體效果變差,目的產物積累趨于穩定[17],故選48 h為最佳誘導時間。

IPTG會抑制菌體生長,誘導目的蛋白的表達,一般IPTG誘導濃度在0.1～1 mmol/L之間。如濃度過低,菌體生長過快消耗營養物質,使目的蛋白表達較少;濃度過高,細菌受到太強的抑制而生長不良,目的蛋白表達減少[8]。如圖4所示,IPTG終濃度在1 mmol/L達到最大MT表達量。

2.2.2 誘導培養基 氮是構成重要生命物質蛋白質和核酸的主要元素,占菌體干重的12%～15%,是微生物發酵的主要營養[22]。枯草芽孢桿菌利用有機氮源的能力優于無機氮源,其中,因酵母浸出物富含氨基酸、維生素以及未知生長因子為枯草芽孢桿菌優良生長氮源。如圖5所示,酵母浸出物+胰蛋白胨+氯化銨(2∶2∶1)組別相較其他組別為最佳誘導發酵培養基的氮源,其峰值MT表達量達到0.083 mg/mL。

圖5 培養基對MT產量的影響Fig.5 Effect of culture medium on production of MT

除水分外,碳源是微生物生長和發酵需要最多的營養物質,占細胞含量的50%[23]。秦艷[21]等認為枯草芽孢桿菌利用單糖和二糖的能力優于多糖,故本實驗選用無機碳源:麥芽糖、蔗糖、葡萄糖三組,有機碳源:甘油一組。如圖5所示,甘油和麥芽糖相比對照組葡萄糖其MT表達量較小,而蔗糖組的MT表達量達到0.075 mg/mL,故選用2%的蔗糖作為誘導發酵培養基的碳源。

蛋白表達過程中,除碳源和氮源外,微量元素對生物活性有很大的調節作用。如圖5所示,無機鹽對MT表達量有利的順序依次為:硫酸鎂>磷酸鹽>空白>氯化鈉。硫酸鎂組別MT的表達量達到0.090 mg/mL,相較空白組別提高了17%,故選用1%的硫酸鎂作為誘導發酵培養基的無機鹽。

2.2.3 誘導金屬量 MT的合成可被許多因素如重金屬、激素等所誘導,并可與多種金屬結合。MT對常見金屬的相對親和力依次為Ag>Hg>Cu>Cd>Zn>Co=Ni[14]。如若金屬流入量超過了現有的MT存留量時,金屬離子則被其他蛋白質利用,同時啟動MT的基因轉錄,加速誘導MT的合成,降低游離金屬離子的水平,同時也有效減少刺激MT合成的因素,從而使細胞內金屬離子數量維持相對平衡[15]。

如圖6所示,Se4+終濃度在50～700 μmol/L范圍內,MT的整體表達水平相較Cd2+和Zn2+并不理想,可能是由于Se4+自身雙性特質,并且需將四價Se4+還原至二價,導致半胱氨酸殘基對Se4+的結合能力有限。其中,當Se4+終濃度為100 μmol/L時,MT表達量達到峰值0.105 mg/mL。

圖6 誘導金屬量對MT產量的影響Fig.6 Effect of metal dose on production of MT

苗蘭蘭[17]等發現MT的兩個結構域包含20個半胱氨酸(Cys)殘基,通常能和7個Zn2+結合。Zn2+終濃度在50～700 μmol/L范圍內,MT的表達量差異性較小,當Zn2+終濃度為700 μmol/L時,MT表達量達到峰值0.115 mg/mL。

當Cd2+終濃度為50 μmol/L時,MT表達量達到峰值0.135 mg/mL,隨著Cd2+濃度的增大,由于Cd自身毒性作用較強,在誘導的同時也會抑制菌體活性,使MT表達量下降[16]。再者,考慮后期金屬脫除實驗中Cd2+的脫除,故選用50 μmol/L為Cd2+誘導終濃度。

綜合考慮MT表達量和金屬誘導劑量,選擇Cd2+為最佳誘導金屬,其終濃度為50 μmol/L。

3 結論

本研究以實驗室保藏的一株高產MT的枯草芽孢桿菌WB-800為對象,進行培育誘導條件優化。枯草芽孢桿菌最優生長條件為:培養溫度37 ℃,培養基初始pH7,搖床轉速220 r/min,接種量4%;最佳誘導發酵條件為:菌液OD600=3.9,IPTG終濃度1 mmol/L,搖床轉速220 r/min,誘導時間48 h,誘導金屬Cd2+終濃度為50 μmol/L,發酵培養基無機鹽為1% MgSO4、碳源為2%蔗糖、氮源為1.5%酵母浸出物+胰蛋白胨+氯化銨(2∶2∶1),MT表達量達到0.135 mg/mL,相較于初始MT產率0.073 mg/mL,優化效果顯著。

現如今極大部分工程菌對MT實行胞內分泌,后期純化過程中需經過細胞反復凍融破壁,采用有機溶劑粗提、濃縮后才能進一步提純,導致發酵時間成本和經濟成本較高。而本實驗所采用菌株對MT實行胞外分泌,MT產率基數大并且發酵液可直接通過升溫、離心、膜分離等物理手段進行提取分離,其操作簡便、經濟,且有效規避了因添加有機溶劑等對發酵產物造成污染,本研究可為MT的大規模工業化生產提供可行性技術途徑。

[1]雍政. 探索一種硒誘導的新型金屬硫蛋白[D]. 北京:中國人民解放軍軍事醫學科學院,2003.

[2]Margoshes M,Vallee B L. A cadmiun protein from equine kidney cortex[J]. Journal of the American Chemical Society,1986,79(17):4813-4814.

[3]Winge D R,Premakumar R,Wiley R D,et al. Copper-chelatin:Purification and properties of a copper-binding protein from rat liver[J]. Archives of Biochemistry & Biophysics,1975,170(1):253-266.

[4]Comeau R D,Mcdonald K W,Tolman G L,et al. Gram scale purification and preparation of rabbit liver zinc metallothionein[J]. Preparative Biochemistry,1992,22(2):151-64.

[5]Naiki N,Yamagata S. Isolation and some properties of copper-binding proteins found in a copper-resistant strain of yeast[J]. Plant and Cell Physiology,1976,17(6):1281-1295.

[6]Olafson R W. Purification of prokaryotic metallothioneins[J]. Methods in Enzymology,1991,205:283-286.

[7]Kneer R,Kutchan T M,Hochberger A,et al.Saccharomycescerevisiaeand Neurospora crassa contain heavy metal sequestering phytochelatin[J]. Archives of Microbiology,1992,157(4):305-310.

[8]吳傳松. 類金屬硫蛋白產生菌的分離培養及特性研究[D].武漢:華中科技大學,2009.

[9]成玉梁,姚衛蓉,錢和. 一種產金屬硫蛋白的釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)發酵工藝的研究[J]. 食品工業科技,2009,30(1):170-173.

[10]路延篤. 金屬硫蛋白突變體的構建、表達及工程菌對重金屬的吸附[D]. 武漢:華中農業大學,2007.

[11]呂品. 金屬硫蛋白基因工程菌的構建及其對重金屬響應的研究[D].太原:山西大學,2011.

[12]蘇艷芳. 人源金屬硫蛋白hMT-I的重組表達及其在乳酸乳球菌的表面展示[D]. 廣州:華南理工大學,2015.

[13]王俊坤. 海洋源金屬硫蛋白的提取、純化和檢測[D]. 青島:中國海洋大學,2013.

[14]徐卓立,雍政,何冰. 蛋白質芯片及其在臨床醫學上的應用[J].國際腫瘤學雜志,2002,29(2):86-89.

[15]王誦濤,謝鵬,張敏紅,等. 金屬離子對細胞內金屬硫蛋白基因調控的影響[J]. 中國畜牧獸醫,2010,37(9):67-69.

[16]Kondo Y,Rusnak J M,Hoyt D G,et al. Enhanced apoptosis in metallothionein null cells[J]. Molecular Pharmacology,1997,52(2):195-201.

[17]苗蘭蘭. 產金屬硫蛋白菌株的誘變育種及蛋白的分離提純[D].大慶:黑龍江八一農墾大學,2013.

[18]宋文龍,叢麗娜,王紅英. 枯草芽孢桿菌發酵條件的優化及微生態制劑的研制[J]. 食品工業科技,2013,34(17):206-209.

[19]周映華,吳勝蓮,賀月林,等. 飼用枯草芽孢桿菌發酵條件的優化[J].湖南農業科學,2010(11):21-23.

[20]張曉玲,陳歷俊,牟光慶. 一株產胞外多糖枯草芽孢桿菌發酵條件的優化[J]. 中國食品添加劑,2012(1):181-185.

[21]秦艷,李衛芬,黃琴. 枯草芽孢桿菌發酵條件的優化[J].飼料研究,2007(12):70-74.

[22]曹文娟,吳蔓莉,張明輝,等. 石油降解菌的篩選優化及其對油污土壤的修復特性[J].環境工程學報,2014,8(12):5493-5498.

[23]袁志輝,王健,楊文蛟,等. 土壤微生物分離新技術的研究進展[J].土壤學報,2014(6):1183-1191.

Optimizationofinducedfermentationconditionsforahigh-yieldingBacillussubtilisofmetallothionein

ZOUJun-jie1,2,3,ZHANGBin1,SUNJi-peng2,3,*,YANGuang-yu2,3

Metallothionein(MT)is a kind of multifunctional inducible protein widely distributed in the organism,with the functions of transportation and storage of metal ions,scavenging free radicals function,activation(inactivation)function of zinc regulatory proteins,and has been one of the hot fields of biology and medicine in basic research and applied research in recent years. In this paper,the fermentation conditions of a strain of high yield recombinantBacillussubtilisstrain were optimized. Through the single factor experiment,the optimal conditions for the growth of recombinantBacillussubtilisas follows,temperature 37 ℃,initial pH7,rotation speed 220 r/min,inoculation amount 4%,and the optimal fermentation conditions of induction as follows,OD600=3.9,IPTG concentration 1 mmol/L,the rotate speed 220 r/min,the induction time 48 h,50 μmol/L Cd2+,MgSO4(1%),sucrose(2%),nitrogen source(1.5%yeast extract+peptone+ammonium chloride)(2∶2∶1),the expression of MT reached 0.135 mg/mL. This study provides some theoretical basis for the development of the natural,efficient marine source metallothionein.

metallothionein;Bacillussubtilis;fermentation

2017-03-03

鄒俊杰(1993-)，男，碩士研究生，研究方向：天然產物開發與利用，E-mail：610720754@qq.com。

*通訊作者:孫繼鵬(1980-)，男，博士，研究方向：海洋藥物與食品化學，E-mail：jpsun@tio.org.cn。

國家海洋局第三海洋研究所基本科研業務費專項資金資助項目(海三科2016031)；福建省科技計劃引導性項目“海洋源金屬硫蛋白基因重組高效表達及發酵技術研究”。

(1.Zhejiang Ocean University,Zhoushan 316022,China;2.Third Institute of Oceanography,State Oceanic Administration,Xiamen 361000,China;3.Fujian Collaborative Innovation Center for Exploitation and Utilization of Marine Biological Resources,Xiamen 361000,China)

TS201.3

:A

:1002-0306(2017)17-0130-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.17.025