產果膠酶黑曲霉的UV誘變及基于葡萄皮渣的固態發酵

,,2,,2, ,2,*

(1.西北農林科技大學葡萄酒學院,陜西楊凌 712100;2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術研究中心,陜西楊凌 712100)

產果膠酶黑曲霉的UV誘變及基于葡萄皮渣的固態發酵

黃丹梅1,宋育陽1,2,劉延琳1,2,秦義1,2,*

(1.西北農林科技大學葡萄酒學院,陜西楊凌 712100;2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術研究中心,陜西楊凌 712100)

對產果膠酶的黑曲霉進行紫外誘變,使用透明圈法并結合液態發酵法進行篩選,獲得果膠酶產量提高的黑曲霉菌株,并利用葡萄皮渣進行固態發酵生產果膠酶。結果表明,H40741、H40493、H40982、H41133、H41134、H41034、H40493和H22148等8株黑曲霉中,H40741產果膠酶最高,對其進行0～360 s紫外誘變,獲得高產果膠酶突變菌株H40741-20,其在果膠液態發酵培養基中可獲得酶活力為462.84 U/mL的果膠酶,是出發菌株的3倍。通過優化固體發酵培養基中的葡萄皮渣、麥麩和水的含量,獲得較佳培養基配方為:葡萄皮渣50 g,麩皮50 g,水100 mL,硫酸銨2 g,硫酸鎂0.07 g,硫酸鉀0.1 g。H40741-20利用此固態培養基發酵,可獲得酶活力為421.06 U/mL果膠酶,是出發菌株H40741的2.7倍。

果膠酶,黑曲霉,紫外誘變,固體發酵,葡萄皮渣

果膠在不同程度上影響天然產物的釋放,在適宜條件下,添加果膠酶有利于天然產物的提取[1-2]。果膠酶是指能夠分解果膠物質的一種復合酶的總稱[3-6]。果膠酶包含聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase,PG)、果膠裂解酶(pentin lyases,PL)、果膠甲酯酶(pectin esterases,PE)和原果膠酶等。

微生物生產果膠酶的來源極其廣泛,包括真菌、細菌、放線菌,如:假單胞菌屬(Pseudomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、歐文式菌(Erwinia)、酵母屬(Saccharomyces)、曲霉屬(Aspergillus)等[7-8]。黑曲霉是國際公認的安全菌株(generally regardedas safe,GRAS),也是美國(FDA)認可使用安全產酶微生物之一,其代謝產物可直接用于食品、飲料、造紙等行業[9-10]。誘變育種是通過誘變劑作用于微生物菌種,并尋找正向突變菌株的一種誘變方法,此方法具有簡單、快速、有效等特點[11-16]。近年國內外學者,如陳勇強[17]、余秋生[18]、N Jafari[19]、G Izmirlioglu[20]等人在黑曲霉的篩選、原生質體選育與誘變育種相結合方面取得了顯著的成果。這些方法是通過誘變因子修改目的微生物的基因組,從而產生突變型菌株。

利用微生物固態發酵(Solid State Fermentation,SSF)生產果膠酶具有原料成本低、來源廣,工藝操作簡單,發酵過程中不需要嚴格執行無菌操作,基質含水量低,反應容器體積小,無環境污染[21]等優點。我國葡萄酒廠眾多,且分布廣泛。每年葡萄酒的生產位居世界前列,同時也產生大量的葡萄皮渣,約占葡萄加工量的25%～30%[22-24]。葡萄皮渣中含有大量的營養物質,如酚類物質(poly-phenolic compounds,PP)含量可達 285～550 mg/kg[25],花青素的含量為6.96 mg/g[26],葡萄籽油約占葡萄籽重量的9%～17%[27],同時葡萄皮渣中也含有一定量的果膠[28]。在過去葡萄酒的釀造過程中,葡萄皮渣被當做廢棄物扔掉,不僅浪費資源,也污染環境。對葡萄皮渣進行廢物重新綜合利用,不僅實現了資源利用的最大化,也降低了對環境的污染。與固態發酵相比,采用液態發酵法進行篩選具有發酵時間短、易操作等優點。因此,本研究采用透明圈法與液態發酵法相結合進行篩選高產果膠酶的黑曲霉菌株,并對篩選所得菌株進行葡萄皮渣固體發酵,為利用葡萄皮渣固體發酵生產果膠酶奠定基礎。

表1 標準樣配制Table 1 Preparation of standard sample

1 材料和方法

1.1材料與儀器

黑曲霉H40741、H40493、H40982、H41133、H41134、H41034、H41278和H2214 中國工業微生物菌種保藏管理中心。

葡萄皮渣 赤霞珠葡萄經壓榨并進行自然曬干后獲得,其果膠含量約為1%～1.6%;麥麩 集貿市場;實驗果膠 上海源葉生物科技有限公司;半乳糖醛酸 北京索萊寶科技有限公司;3,5-二硝基水楊酸 國藥集團化學試劑有限公司;硫酸鎂、硝酸鈉、硫酸鐵、硫酸銨、硫酸鉀、磷酸氫二鉀、氫氧化鈉、氯化鈉、丙三醇等均為分析純級。

UV1800紫外可見分光光度計 Agilent Technologies;PB-10酸度計 北京賽多利斯儀器系統有限公司;QYC-2112型恒溫搖床 上海福馬實驗設備有限公司;MJPS-250霉菌培養箱 上海精宏實驗設備有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1 主要試劑的配制 DNS試劑:3.25 g 3,5-二硝基水楊酸,162.5 mL 2 mol/L氫氧化鈉,22.5 g丙三醇,定容至500 mL[29]。

pH5.0磷酸-檸檬酸緩沖液[29]:取71.62 g十二水合磷酸氫二鈉,21.01 g檸檬酸,分別定容至1000 mL,按10.3∶9.7混合。

盧戈氏碘液:將2 g碘化鉀溶解于少量蒸餾水中,再將1 g碘溶解在碘化鉀溶液中,待碘溶解完全后定容至300 mL,避光保存。

1.2.2 培養基 斜面培養基(PDA) 200 g馬鈴薯(去皮,切塊,加水,煮沸30 min,破碎,用紗布過濾,濾液加糖,定容至100 mL),20 g瓊脂,20 g葡萄糖,1000 mL蒸餾水,pH自然。

果膠培養基(%)0.1 g磷酸氫二鉀,0.5 g硫酸鎂,0.3 g硝酸鈉,0.001 g硫酸鐵,2.0 g瓊脂,0.2 g實驗果膠,pH5.5[30-31]。

液態發酵培養基(%)0.1 g磷酸氫二鉀,0.5 g硫酸鎂,0.3 g硝酸鈉,0.001 g硫酸鐵,0.2 g實驗果膠,pH5.5。

1.2.3 高產果膠酶菌株的篩選 依據Qu E J等[16]的研究透明圈直徑(Dp)與菌落直徑(Dc)比值較大產果膠酶的酶活相應較高。為了獲得產果膠酶酶活最高的黑曲霉菌株,本實驗對初篩中Dp/Dc比值較大的幾株黑曲霉菌株進行復篩。

初篩:將黑曲霉菌種接種于PDA斜面培養基上,28 ℃條件下恒溫培養5～7 d。將培養好的黑曲霉斜面菌株存放于-4 ℃冰箱中。取活化好的斜面菌株1支,加入無菌水沖洗孢子,制成均勻的孢子濃度為106個/mL的孢子懸液,將菌懸液分別稀釋10-6、10-5、10-4、10-3倍。用移液槍吸取100 μL稀釋后的菌液接種在無菌果膠平板培養基上(每個梯度做3個平行),涂抹均勻,倒置于30 ℃條件下恒溫培養3～4 d[15]。將平板上的單菌落保藏于甘油凍存管中,再向平板中加入5 mL盧戈氏碘液,靜止2 min后將碘液倒出,再加入5 mL生理鹽水放置10 min后倒出,24 h后可見明顯透明圈,選取透明圈直徑(Dp)與菌落直徑(Dc)比值較大的菌[16]進行復篩。

復篩:準確稱取半乳糖醛酸1.0 g,用pH5.0磷酸-檸檬酸緩沖液定容至1000 mL,得到1 mg/mL的半乳糖醛酸標準溶液。取9支25 mL的具塞管并編號,并按表1加入各種試劑,混合均勻,沸水浴5 min,流水冷卻,加蒸餾水定容至25 mL,用紫外分光光度計在540 nm波長處測定吸光度值。以吸光度值(A)為橫坐標,半乳糖醛酸濃度(B mg/mL)為縱坐標,繪制標準曲線,得標準曲線方程為B=1.6269×A-0.0118(R2=0.9982)。

在300 mL錐形瓶中加100 mL液體果膠培養基,用接種環沾取菌種接于液體培養基中,28 ℃,260 r/min條件下培養2～3 d,將培養液于3600 r/min下離心8 min,取上清液作為待測粗酶液。

1.2.4 果膠酶酶活測定 采用DNS法測果膠酶酶活力,在15 mL具塞管中加入0.8 mL 1.0%的果膠溶液,50 ℃恒溫水浴3 min,加入0.2 mL適當稀釋的粗酶液,精確反應10 min后加入3 mL DNS,混勻后沸水浴10 min,流水冷卻,蒸餾水定容至15 mL,在紫外分光光度計540 nm波長處測定吸光值,以滅活酶液為空白對照[32-33]。酶活力計算:

X(U/mL)=[(A1-A2)×Dr×3]/(K×t)

式(1)

式(1)中A1為樣品吸光度值,A2為空白對照吸光度值;K為標準曲線的斜率,Dr是稀釋倍數;t為反應時間(h)。

1.2.5 紫外誘變 紫外照射劑量:取28 ℃培養5 d的上述步驟1.2.4所得到的酶活力最高的菌株,用0.9%的生理鹽水沖洗孢子,將孢子懸浮液置于無菌的錐形瓶中,放入幾粒玻璃珠振蕩使孢子分散,用四層無菌擦鏡紙過濾,然后用生理鹽水將孢子懸浮液濃度調整到106個/mL,該步驟在血球計數板上計數[34]。取7個直徑9 cm培養皿,分別加入6 mL上述孢子懸浮液。將15 W的紫外燈打開,預熱20 min使光波穩定。將盛有懸浮液的培養皿置于距紫外燈垂直距離30 cm處,打開培養皿蓋子照射(照射計時從開蓋起,加蓋停),照射時間分別為0、60、120、180、240、300、360 s。從每個照射時間的培養皿中取出菌懸液,分別稀釋10、100、1000倍。吸取100 μL稀釋后的菌懸液,涂布于果膠平板培養基上,每個濃度做3個平行,全程均在紅光燈下進行。將培養皿用鋁箔紙包裹以避光,放置于28 ℃培養箱中倒置培養3～4 d,待菌落長好后計算不同照射時間下的致死率并保存,計算公式為

F(%)=[(A-B)/A]×100

式(2)

式(2)中F為致死率;A為原菌落數;B為誘變后菌落數。

突變株的篩選:將上述誘變菌株計數并保存后采用盧戈氏碘液染色法,分別觀測透明圈直徑(Dp)與菌圈直徑(Dc)大小,并計算Dp/Dc比值,找出Dp/Dc比值大的菌株進行酶活力測定。

突變株酶活力的測定:將篩選得到的突變菌株進行活化培養,制備粗酶液。然后采用上述步驟1.2.4所述方法測定突變菌株的果膠酶酶活力。

1.2.6 形態觀察 采用插片法[34]將滅菌后的蓋玻片斜插在培養基上,用接種環將菌種接種在蓋玻片一側,放入培養箱28 ℃條件下培養4～5 d,電子顯微鏡下觀察菌株形態。待菌株生長后用無菌刀片切一小塊長有菌落的培養基,于電子顯微鏡下進行觀察并拍下照片。將剩下的培養基繼續放置培養箱中,定期取出進行電子顯微鏡觀察與拍照。

1.2.7 突變株和出發菌株固體發酵 葡萄皮渣用于固態發酵[35]的培養基配方為:葡萄皮渣的添加量分別為0、10、30、50、70、90 g,采用麥麩補足至100 g,每組分別添加100、200 mL水,均添加2 g硫酸銨,0.07 g硫酸鎂,0.1 g硫酸鉀,以進行固體發酵培養基中葡萄皮渣、麥麩與水的配比優化。

將篩選得到的出發菌株和上述步驟1.2.4測得酶活力最高的突變菌株進行固體發酵,發酵培養基滅菌后接入2 mL孢子懸浮液,28 ℃條件下培養4～5 d。固體發酵結束后,將錐形瓶中的培養基轉移至燒杯中,并在燒杯中加入料液比1∶10 (g∶mL)的含0.01%吐溫-80的蒸餾水,在30 ℃條件下恒溫浸提50 min后用3層紗布進行過濾,將所得液體在4000 r/min下離心15 min,所得上清液即為粗酶液[30],并測定其果膠酶酶活力,方法同上述步驟1.2.4。

1.3數據統計分析

用軟件Origin 8繪制出黑曲霉菌株篩選和發酵的果膠酶酶活力圖,用SPSS進行差異顯著性分析,p<0.05差異顯著。

2 結果與討論

2.1產果膠酶菌株的篩選

通過采用果膠培養基培養對H40741、H40493、H40982、H41133、H41134、H41034、H41278和H2214等八株黑曲霉菌株進行定性篩選。根據菌株的生長情況和水解果膠的能力,采用盧戈氏碘液染色法篩選出Dp/Dc比值較大的菌株。通過初篩得到H40741、H41134、H41133和H40982四株菌株的Dp/Dc比值分別為2.2、1.4、1.5、1.4,較另外四株黑曲霉的Dp/Dc比值大,如圖1所示。

圖1 八株黑曲霉菌株染色后的透明圈Fig.1 Transparent circle of eight aspergillus niger strains after dyeing

從圖2可以看出,黑曲霉菌株H40741的酶活高于其他菌株,酶活力達到154.15 U/mL。據方差分析,復篩菌株H40741產果膠酶的酶活力較H41133、H411134、H40982三株菌的產果膠酶活力具有顯著差異(p<0.05)。

圖2 復篩菌株產果膠酶的酶活力Fig.2 Enzyme activity of pectinase produced by re-screening strains

2.2出發菌株紫外誘變

結果表明紫外照射時間對菌株H40741的致死非常顯著,當照射時間為240 s時,致死率可以達到91%(圖3)。將紫外誘變0、60、120、180、240、300、360 s后的菌懸液稀釋1000倍,將稀釋后的孢子懸液涂布于果膠平板培養基上,28 ℃條件下恒溫培養3 d進行初篩。實驗發現,誘變后的菌落大小差異顯著(p<0.05),甚至個別菌落難以形成孢子(圖4)。說明在紫外誘變過程中菌株不僅發生了正突變,同時也發生了負突變[36]。出發菌株H40741對紫外線較為敏感且果膠酶的酶活力比H41133、H411134、H40982三株菌都高,是一株適宜于進行誘變育種的菌株。

圖3 紫外誘變致死率曲線Fig.3 The curve of UV-mutation lethality

圖4 紫外照射時間與菌的存活數Fig.4 UV irradiation time and survival number of strains注:從上到下、從左到右,誘變時間依次為0、60、120、180、240、300、360 s。

2.3紫外誘變菌株的篩選

結果顯示各菌株的Dp/Dc比值均有提高(圖5)。據方差分析,各菌株的Dp/Dc比值都有較顯著的提高(p<0.05),其中H40741-20菌株提高的最為顯著(p<0.05)(圖6)。

圖5 264株誘變菌株Dp/Dc比值Fig.5 The ratio Dp/Dc of 264 mutant strains

圖6 出發菌株H40741與誘變菌株H40741-20的透明圈Fig.6 Transparent circle of original strain H40741 and mutant strain H40741-20

圖7 七株Dp/Dc比值較大的黑曲霉突變菌株果膠酶酶活力Fig.7 The enzyme activity of seven aspergillus niger mutant strains with higher ratio Dp/Dc注:圖中不同字母代表在Duncan檢驗中差異顯著(p<0.05)。

將初篩所獲得的Dp/Dc比值較大的7株黑曲霉突變株H40741-2、H40741-3、H40741-19、H40741-20、H40741-42、H40741-57、H40741-61分別進行液態發酵,并檢測果膠酶的酶活力,最終篩選得到一株高產果膠酶的突變菌株H40741-20,其果膠酶酶活力達到462.84 U/mL,是出發菌株H40741的3倍(圖7)。對酶活力值進行顯著性分析發現,除H40741-19與H40741-3,H40741-2與H40741-61無顯著性差異外(p>0.05),其余菌株間均有顯著性差異(p<0.05)。因此,將果膠酶酶活力提高最多的誘變菌株H40741-20用于葡萄皮渣的固態發酵實驗。

2.4突變菌株形態學鑒定

突變株H40741-20在顯微鏡下的孢子囊形態,菌叢黑褐色,頂囊為大球形,小梗雙層,分生孢子為球形,呈黑色,表面粗糙(圖8),與唐文俊[37]等人研究的黑曲霉菌體形態比較相符。通過與出發菌株對比發現,經過紫外誘導后的孢子囊明顯小于出發菌株的孢子囊。

圖8 突變株H40741-20在顯微鏡下的孢子囊形態Fig.8 Sporangial morphology of mutant strain H40741-20 under the microscope注:顯微鏡放大倍數為100倍。

2.5葡萄皮渣固態發酵

麥麩中含有纖維素、低聚糖、β-淀粉酶等多種營養物質,其中纖維類物質約占30%,糖類物質約占70%[38]。因此,麥麩可作為碳源與氮源,且具有一定的疏松度,能夠給黑曲霉的生長提供充足的氧氣。與麥麩相對比,葡萄皮渣中果膠物質約占1.0%～1.6%[39],而果膠酶屬于誘導酶,葡萄皮渣既可作誘導物又可作碳源。添加葡萄皮渣能有效提高果膠酶的產量,且果膠酶活力最高能提高266.91 U/mL。通過調整葡萄皮渣和麥麩的配比,不僅有利于提高果膠酶的產量,還能減少原料的浪費。研究發現,隨著葡萄皮渣添加量每增加20 g,果膠酶活力提高150 U/mL左右。當葡萄皮渣含量超過50%時,若繼續增加其含量,菌絲的生長會更加旺盛,但果膠酶酶活力會隨之降低(圖9)。因此,固體發酵培養基中葡萄皮渣與麥麩質的添加量分別為50、50 g最合適。

圖9 不同質量的葡萄皮渣與麥麩發酵的酶活力Fig.9 Enzyme activity of fermentation of grape skin residue and bran in different quality

3 結論

本研究采用液態發酵與紫外誘變獲得產果膠酶活力最高的菌株H40741-20,將其與出發菌株H40741分別進行葡萄皮渣固態發酵。通過優化固體培養基配比,發現當葡萄皮渣50 g、麥麩50 g、水100 mL時,H40741-20的酶活力最高(421.06 U/mL),較H40741提高173.15%。因此,以葡萄皮渣為原料進行發酵生產果膠酶,既能做到資源的合理利用和降低環境污染,又能實現葡萄酒廢棄資源利用的最大化。

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UVmutagenesisofAspergillusnigerforincreasingpectinaseproductionanditssolid-statefermentationusinggrapeskinresidue

HUANGDan-mei1,SONGYu-yang1,2,LIUYan-lin1,2,QINYi1,2,*

(1.College of Enology,Northwest A&F University,Yangling 712100,China; 2.Shaanxi Engineering Research Center for Wine and Viticulture,Yangling 712100,China)

For increasing pectinase productiont,UV light was used to produceAspergillusnigermutagenesis,and the grape skin residue was used to produce pectinase byAspergillusniger. The results showed that,in the eightAspergillusnigerstrains H40741,H40493,H40982,H41133,H41134,H41034,H40493 and H22148,the H40741 has the highest pectinase activity. Ultraviolet light on H40741 spores 0～360 s,and we obtained a high yield pectinase mutant strain H40741-20. The pectinase activity was 462.84 U/mL in pectin liquid fermentation medium,which was 3 times of the original strain. By optimizing the contents of grape skin residue,wheat bran and water,we obtained a better medium formula was grape skin residue 50 g,wheat bran 50 g,water 100 mL,ammonium sulfate 2 g,magnesium sulfate 0.07 g,potassium sulfate.The pectinase enzyme activity was 421.06 U/mL,which was 2.7 times higher than that of the original strain H40741 by using this optimized solid medium.

pectinase;Aspergillusniger;UV mutagenesis;solid-state fermentation;grape skin residue

2017-01-20

黃丹梅(1992-),女,在讀碩士研究生,研究方向:釀酒微生物,E-mail:hdmhuang92@163.com。

*通訊作者:秦義(1982-),男,博士,講師,研究方向:釀酒微生物學,E-mail:qinyi@nwsuaf.edu.cn。

國家自然基金(3050215184);國家現代農業(葡萄)產業技術體系建設專項(CRAS-30-jg-3)。

TS201.3

:A

:1002-0306(2017)17-0125-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.17.024