響應面法優化復合乳酸菌抑制熒光假單胞菌作用

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(1.渤海大學食品科學與工程學院,遼寧省食品安全重點實驗室,生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心,遼寧錦州 121013;2.北京林業大學生物科學與技術學院,北京 100083;3.大連東霖食品股份有限公司,遼寧大連 116101)

響應面法優化復合乳酸菌抑制熒光假單胞菌作用

孫夢桐1,馬歡歡1,呂欣然2,林洋1,白鳳翎1,*,勵建榮1,宋強3

(1.渤海大學食品科學與工程學院,遼寧省食品安全重點實驗室,生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心,遼寧錦州 121013;2.北京林業大學生物科學與技術學院,北京 100083;3.大連東霖食品股份有限公司,遼寧大連 116101)

目的:優化抑制熒光假單胞菌的復合乳酸菌組合。方法:應用牛津杯瓊脂擴散法篩選對熒光假單胞菌具有協同抑制作用的復合乳酸菌,通過響應面法進行優化。結果:從11組復合乳酸菌中篩選獲得LactobacillusplantarumDY4-2、Lb.sakeiYP4-5和Lb.sakeiLY1-6組合的抑菌作用最強,對熒光假單胞菌的抑菌直徑為25.29 mm,比DY4-2、YP4-5和LY1-6單菌株分別高出2.93、4.80和5.35 mm。利用Box-Behnken進行三因素三水平的實驗設計,以抑菌直徑為響應值進行分析,優化最佳條件為:菌株DY4-2、YP4-5和LY1-6復合比 2∶3∶1、培養溫度25 ℃、培養時間為48 h,優化的抑菌直徑為25.84 mm。結論:乳酸菌復合可有效增加菌株間的協同作用,增加對熒光假單胞菌的抑菌活性,為研發高效控制水產品腐敗菌乳酸菌生物制劑提供理論依據。

復合乳酸菌,熒光假單胞菌,抑菌作用,響應面,優化

熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)可引起低溫條件下魚類、蝦和蟹等水產品的腐敗變質[1-2]。崔方超等[2]從冷藏大菱鲆體表分離獲得導致魚體腐敗的特定腐敗菌菌株P001,經鑒定為Pseudomonasfluorescens。同時,天然魚類腸道也是拮抗性乳酸菌的主要來源,Zhang等[3]從黑鯛魚腸道中分離獲得1株乳酸菌Leuconostoclactis對Proteusvulgaris、EscherichiacoliO157和Salmonellatyphimurium抑菌直徑分別為13.30、13.70、12.70 mm。繆璐歡等[4]研究從鯉魚腸道中分離出對EscherichiacoliO157∶H7具有較強拮抗活性的菌株LactobacillussakeiLY-19和LactobacillusplantarumLY-21,其抑菌直徑分別為15.98 mm和16.32 mm。Kaynar等[5]從紅鯛魚腸道中分離獲得菌株LactobacillusxylosusHC9對目標菌BacillusmegateriumP4具有較強的抑制作用。本研究前期應用從鱸魚腸道獲得LactobacillussakeiLY1-6對P.fluorescens進行抑制作用研究,并已取得良好效果[6]。但尚未應用復合乳酸菌對大菱鲆中優勢腐敗菌P.fluorescens進行抑菌作用研究。

表1 海魚源性乳酸菌的11種不同組合Table 1 The 11 different composition of LAB derived marine fish

復合乳酸菌是將兩種或兩種以上的乳酸菌菌株混合后共培養,其發酵能力和抑菌效果均強于單株乳酸菌[7]。復合乳酸菌在食品生產和保鮮中的應用已有相關報道[8]。徐安書等[9]研制莖瘤芥葉胡蘿卜混合汁復合乳酸菌發酵飲料,發現用嗜熱鏈球菌、植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌按1∶1∶1比例接種量2%研制的活菌型蔬菜汁復合乳酸菌發酵飲料,在4 ℃低溫條件下可保存1個月。唐文靜等[10]研究發現復合乳酸菌(LactobacilluscaseiLC1、LactobacillusplantarumLP1和乳酸菌L3)對Pseudomonasfragi和Shewanellaputrefacens抑菌效果強于單株乳酸菌,且4 ℃冷藏條件下與單株乳酸菌相比,復合乳酸菌有效延長了冷藏海鱸魚塊貯藏期。

響應面法(response surface methodology,RSM)基于數學與統計學結合,以體系的響應作為一個或多個因素的函數,擬合獲得二次多項回歸方程,并運用圖形將函數關系表示出,后選擇實驗設計中的最優化條件[11]。可有效、快速地確定多因子系統的最優條件,已廣泛應用于各類發酵條件和工藝參數等條件的優化[12-14]。

本文利用來源于海魚腸道中無交叉拮抗作用的乳酸菌為出發菌株,篩選對熒光假單胞菌具有協同抑制作用的乳酸菌組合。采用響應面法優化復合乳酸菌的菌量比、培養溫度和培養時間等因素,以增強復合乳酸菌的抑菌效果,旨在為應用乳酸菌生物防腐劑控制水產品中熒光假單胞菌提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

乳酸菌菌株及來源 本實驗室前期從海水魚類腸道中分離獲得的乳酸菌,S1(LactobacillusplantarumLP1-4)分離于大菱鲆腸道,S2(LactobacillusplantarumDY4-2)分離于刀魚腸道,S3(LactobacillussakeiYP4-5)分離于牙鲆腸道,S4(LactobacillussakeiLY1-6)分離于鱸魚腸道;指示菌PseudomonasfluorescensP001,分離于大菱鲆體表;MRS培養基、MRS營養瓊脂、LB肉湯、LB營養瓊脂培養基 北京奧博星生物技術有限公司;脫脂乳 上海鈺博生物科技有限公司。

PHSJ-3F實驗室pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司;DL-CJ-2N型超級潔凈工作臺 東聯哈爾(北京)儀器制造有限公司;LRH系列生化培養箱 上海一恒科學儀器有限公司;賽福智能生化培養箱 寧波海曙賽福實驗儀器廠;GI54DS立式高壓蒸汽滅菌鍋 致微(廈門)儀器有限公司;IKA旋渦振蕩器 北京卓信偉業科技有限公司;IKA磁力攪拌器 北京悠揚機電設備有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1 拮抗性乳酸菌測定 將保藏于-80 ℃ 4株乳酸菌分別接種于10%脫脂乳37 ℃活化12 h,后接種于MRS平板上連續培養2代至正常代謝水平。挑取活化后乳酸菌單菌落接種于MRS液體培養基中,37 ℃培養24 h,以熒光假單胞菌為指示菌,參照alomskiené等[15]利用牛津杯瓊脂擴散法用制備好的發酵液進行抑菌實驗。4株乳酸菌經無菌生理鹽水10倍梯度稀釋,制成約106CFU/mL菌懸液,4 ℃保存備用。

1.2.2 抑制熒光假單胞菌乳酸菌的交叉拮抗實驗 參照李曼等[16]方法并稍作修改,采用交叉拮抗法篩選4株乳酸菌分別選用其中一株乳酸菌為供試菌株,其余3株乳酸菌菌株為目標菌。按照1.2.1進行抑菌實驗。

1.2.3 抑制熒光假單胞菌復合乳酸菌抑菌實驗 4株乳酸菌按排列組合C(n,m)得到11種混合乳酸菌組合(見表1),組內按1∶1、1∶1∶1和1∶1∶1∶1的比例將制備好的乳酸菌菌懸液混合,后分別以2%接種量置于10 mL MRS液體培養基,37 ℃培養48 h。按照1.2.1進行抑菌實驗。

1.2.4 單因素及響應面實驗設計

1.2.4.1 菌量比對熒光假單胞菌抑制作用的影響 將上述1.2.3實驗得到對熒光假單胞菌具有最佳抑菌效果的組合進行正交實驗,設計三因素三水平見表2。獲得不同配比的乳酸菌組合,按照表中不同乳酸菌菌量的配比將制備好的乳酸菌菌懸液進行混合,后分別以2%的接種量置于10 mL MRS液體培養基,37 ℃培養48 h,按照1.2.1進行抑菌實驗。

表2 三因素三水平正交表Table 2 The orthogonal table of three factors and three levels

表4 乳酸菌對熒光假單胞菌抑制作用Table 4 The inhibitory activity of LAB against P. fluorescens

1.2.4.2 培養溫度對熒光假單胞菌抑制作用的影響 選擇培養溫度20、25、28、30、35、37 ℃,取200 μL復合乳酸菌懸液(菌量比為2∶3∶1)于10 mL MRS液體培養基中,分別在不同的培養溫度條件下培養48 h,取發酵液按照1.2.1進行抑菌實驗。

1.2.4.3 培養時間對熒光假單胞菌抑制作用的影響 選擇培養時間為12、24、32、48、60、72 h,取200 μL復合乳酸菌菌液(復配比例2∶3∶1)接種于10 mL MRS液體培養基中,25 ℃靜置培養,取不同培養時間的發酵液按照1.2.1進行抑菌實驗。

1.2.5 響應面法優化抑菌條件 在單因素實驗的基礎上,選取菌株DY4-2、YP4-5 和LY1-6菌量比、溫度和時間這3個因素作為多因素交叉組合實驗的考察因素,以抑菌直徑作為響應值,利用響應面方法中的Box-Behnken Design方法設計實驗,通過實驗數據擬合得到二階響應模型,最終確定最優實驗條件。每一個自變量的低、中、高水平分別以-1、0、1進行編碼。實驗因素水平編碼見表3。

表3 Box-Behnken中心組合實驗設計因素和水平Table 3 Factors and levels of Box-Behnken design

1.2.6 數據處理 實驗均重復測定3次,數據采用平均值±標準差表示。采用SPSS 18.0和Design Expert 8.06軟件對數據進行統計學分析,采用Origin 8.0軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1拮抗性乳酸菌測定

4株乳酸菌發酵液對熒光假單胞菌的抑菌結果如表4所示,從中可看出,4株乳酸菌對熒光假單胞菌均具有較好的抑制作用,其中菌株DY4-2 抑菌效果最強,抑菌圈直徑為20.36 mm;LP1-4次之,抑菌圈直徑為19.61 mm;菌株LY1-6和YP4-5相對較弱。

2.2乳酸菌菌株間的交叉抑制作用

圖1是乳酸菌菌株間交叉抑制測定結果(指示菌:LP1-4;供試菌:DY4-2、YP4-5和LY1-6),從中可看出,菌株DY4-2、YP4-5和LY1-6均無抑菌圈出現,表明菌株LP1-4與其余3株菌間無抑制作用。后分別以菌株DY4-2、LY1-6和DY4-2作為指示菌,也均無抑制作用(圖均未列出)。結果表明,4株乳酸菌均無交叉抑制作用。因此,可作為復合乳酸菌實驗的標準菌株。

圖1 乳酸菌菌株間交叉拮抗結果Fig.1 Cross antagonistic results of strain of lactic acid bacteria

2.3抑制熒光假單胞菌復合乳酸菌抑菌實驗

4株乳酸菌按排列組合C(n,m)得到11種混合乳酸菌組合抑菌結果圖2所示,A圖是第1組、第8組和第11組抑菌效果圖,從中可看出,第8組復合乳酸菌抑菌直徑明顯大于其余2組,對熒光假單胞菌抑制作用最強,抑菌直徑為25.29 mm。B圖為11組的復合乳酸菌抑菌結果,復合乳酸菌的第1～5組和10～11組對熒光假單胞菌抑菌效果較差,抑菌圈直徑均處于20.00 mm左右,而第6～9組的復合乳酸菌抑菌效果較強,抑菌圈直徑均高于22.00 mm。第8組抑菌作用最強,其次是第6、7和9組,抑菌直徑分別為22.45、22.11、23.05 mm。因此,選用第8組(S2:菌株DY4-2、S3:菌株YP4-5 和S4:菌株LY1-6)作為最佳復合乳酸菌組合進行下一步研究。

圖2 乳酸菌不同組合對熒光抑菌抑菌結果Fig.2 The results of the different composes of LAB on P. fluorescent 注:第1組:S1、S2;第8組:S2、S3、S4;第11組:S1、S2、S3、S4。

2.4單因素實驗結果分析

2.4.1 復合乳酸菌不同菌量比的抑菌實驗 采用三因素三水平設計最佳抑菌效果的乳酸菌組合(A:菌株DY4-2,B:菌株YP4-5,C:菌株LY1-6),如表5所示,為不同菌量比對熒光假單胞菌抑制結果。從中可以看出,第6組A2B3C1(2∶3∶1)抑菌作用最強,抑菌直徑為24.25 mm。因此,確定復合乳酸菌第6組為最適菌量比。

表5 不同配比的乳酸菌組合對熒光假單胞菌抑制影響Table 5 Antibacterial effect of the different proportions of LAB on P. fluorescent

2.4.2 培養溫度對抑制熒光假單胞菌的影響 將菌株DY4-2、YP4-5和LY1-6按菌量比2∶3∶1混合后接種于MRS培養基中,不同溫度下培養48 h后乳酸菌發酵液的抑菌結果如圖3所示。從中可看出,隨著培養溫度的升高,復合乳酸菌抑菌效果呈先上升再下降、再上升又下降的趨勢,當溫度小于35 ℃時,對熒光假單胞菌的抑菌效果較強,抑菌圈直徑均高于23.00 mm,溫度37 ℃時,抑菌圈直徑維持在20.00 mm左右。表明復合乳酸菌在較低的溫度下培養產生的抑菌活性物質對熒光假單胞菌具有較強抑制作用。培養溫度25 ℃抑菌效果最好,抑菌直徑為24.26 mm。因此,確定復合乳酸菌培養溫度為25 ℃為抑菌活性物質產生的最適培養溫度。

圖3 不同溫度的復合乳酸菌對熒光假單胞菌抑菌結果Fig.3 The bacteriostatic results of different temperatures of LAB on P. fluorescent

2.4.3 培養時間對抑制熒光假單胞菌的影響 復合乳酸菌(菌量比2∶3∶1)接種于MRS培養基后置于25 ℃培養不同時間,乳酸菌發酵液的抑菌結果如圖4所示。從中可看出,隨著培養時間的延長,乳酸菌發酵液對熒光假單胞菌抑菌效果逐漸上升后下降的趨勢,當培養48 h時,抑菌圈直徑為24.39 mm,培養時間60～72 h時,抑菌圈直徑維持在23.70 mm左右。表明復合乳酸菌培養48 h時,抑菌活性物質已完全形成。因此,確定復合乳酸菌抑菌活性物質產生的最適培養時間為48 h。

圖4 不同時間的復合乳酸菌對熒光假單胞菌抑菌結果Fig.4 The bacteriostatic results of different time of LAB on P. fluorescent

2.5響應面對復合乳酸菌抑制熒光假單胞菌抑菌條件的優化

2.5.1 響應面法優化培養條件 通過Design Expert 8.0.6中的Box-Behnken 對菌量比(A)、溫度(B)和時間(C)進行三因素三水平實驗,所得的中心組合方案和實驗結果如表6所示。

表6 Box-Behnken中心組合設計方案及實驗結果Table 6 Design and results of Box-Behnken

表7 回歸模型方差分析Table 7 Variance analysis of regression mode

注:**極顯著(p<0.01),*顯著(p<0.05)。

以抑菌直徑(Y)為響應值,根據Box-Behnken Design(BBD)設計的實驗結果,利用Design Expert 8.0.6軟件對表6數據進行分析,得到抑菌圈直徑與菌量比(A)、溫度(B)和時間(C)二次多項回歸方程:Y=20.94-0.21A-0.44B-1.26C+0.39AB+0.10AC-0.007BC+0.62A2+1.03B2+1.14C2。對回歸模型進行方差分析,結果如表7所示。

從表7可看出,模型F=8.94,p<0.01,說明該回歸方程極顯著。失擬項不顯著(p>0.05),說明模型所擬合的二次回歸方程與實際相符合。能正確反映抑菌圈直徑Y與A、B和C之間的關系。回歸模型可以較好地對優化實驗中的各種實驗結果進行預測。顯著性檢驗結果表明,一次項的培養時間和二次項的溫度和時間對抑菌圈直徑有極顯著影響(p<0.01)。決定系數R2=0.9200,說明模型的擬合度好,抑菌圈直徑的實際值與預測值之間具有較好的擬合相關性。方差分析結果表明,各因素對抑菌圈直徑的影響順序依次為時間、溫度和菌量比。

圖5為菌量比A、培養溫度B和培養時間C三因素的兩兩交互作用分析所得到的交互因子響應曲面圖。a圖中在等高線區域中心,抑菌直徑最小,由中心向邊緣逐漸增大。若底部投影為橢圓形,則兩因素交互作用顯著,由此可知溫度與菌量比之間的交互作用顯著,菌量比與培養時間、培養溫度與培養時間之間的交互作用不顯著。b和c圖顯示了C由高水平到低水平變化過程中等高線的數目明顯多于A和B,說明培養時間對抑菌直徑的影響顯著。對多元二次回歸方程進行求偏導,可以得到:Y=-0.21+0.39B+0.10C+1.24A;Y=-0.44+0.39A-0.007C+2.06B;Y=-1.26C+0.10A-0.007B+2.28C;聯立方程組,解得復合乳酸菌對熒光假單胞菌抑菌活性最優條件的編碼值為:A=-1,B=-1,C=-1。即在菌株DY4-2、YP4-5和LY1-6菌量比為2∶3∶1,培養溫度為25 ℃,培養時間48 h時,模型預測復合乳酸菌對熒光假單胞菌抑菌直徑最大值為26.13 mm。

圖5 交互因子的響應面曲面圖Fig.5 Response surface graph of interaction factors

2.5.2 驗證性實驗 響應值(Y)最大值時各因子水平為A=-1,B=-1,C=-1。對應的最佳培養條件為菌株DY4-2、YP4-5和LY1-6菌量比為2∶3∶1,培養溫度為25 ℃,培養時間48 h時,在此條件下預測的最大值為26.13 mm。為了驗證模型預測的準確性,依據響應面實驗優化得到的培養條件進行驗證性實驗,得到復合乳酸菌對熒光假單胞菌抑菌圈直徑為25.84 mm,與模型預測值相差1%,與理論值基本相符。

3 結論

通過Box-Behnken設計和響應面分析法,利用Design-Expert統計軟件能夠可靠地進行優化實驗以及數據處理。本實驗應用這一方法對復合乳酸菌對熒光假單胞菌的抑菌活性進行優化,在單因素實驗的基礎上應用Box-Behnken設計三因素三水平的實驗,確定復合乳酸菌抑制熒光假單胞菌的培養條件為:乳酸菌組合(S2:菌株DY4-2、S3:菌株YP4-5 和S4:菌株LY1-6)以2∶3∶1菌量比,在25 ℃條件下培養48 h 時,抑菌直徑為25.84 mm,與模型預測值相差1%,該模型可以較好地預測實際情況。因此,菌株DY4-2、YP4-5 和LY1-6復合后可有效增加抑制熒光假單胞菌能力,旨在為應用乳酸菌生物防腐劑控制水產品中熒光假單胞菌提供理論依據。

[1]Zhou Z J,Zhang L,Sun L.Pseudomonasfluorescens:Fur is required for multiple biological properties associated with pathogenesis[J]. Veterinary Microbiology,2015,175(1):145-149.

[2]崔方超,李婷婷,劉明爽,等. 大菱鲆熒光假單胞菌的群體感應現象及不同碳源培養下的腐敗特性研究[J]. 現代食品科技,2015,31(12):49-55.

[3]Zhang W,Liu M,Dai X. Biological characteristics and probiotic effect ofLeuconostoclactisstrain isolated from the intestine of black porgy fish[J]. Brazilian Journal of Microbiology,2013,44(3):685-691.

[4]繆璐歡,杜靜芳,馬歡歡,等. 淡水魚腸道中抗大腸桿菌O157∶H7乳酸菌的篩選及抑菌作用研究[J]. 食品與發酵工業,2015,41(10):7-13.

[5]Kaynar P,Beyatli Y. Antagonistic activities of Bacillus spp. strains isolated from the fishes[J]. Journal of Applied Biological Sciences,2012,6(3):77-81.

[6]馬歡歡,呂欣然,林洋,等. 鱸魚腸道LactobacillussakeiLY1-6對熒光假單胞菌抑制作用研究[J].食品工業科技,2016,37(23):150-155.

[7]王菲,張繼倫,寧喜斌. 復合乳酸菌對腸出血性大腸桿菌O157∶H7抑制作用的研究[J]. 食品工業科技,2013,34(21):83-86.

[8]Cao R,Liu Q,Chen S,et al. Application of lactic acid bacteria(LAB)in freshness keeping of tilapia fillets as sashimi[J]. Journal of Ocean University of China,2015,14(4):675-680.

[9]徐安書,胡敏,何軍. 莖瘤芥葉胡蘿卜混合汁復合乳酸菌發酵飲料的研制[J]. 食品科學,2012,33(14):321-325.

[10]唐文靜,寧喜斌,王楚文,等. 復合乳酸菌對冷藏海鱸魚塊的保鮮效果[J]. 微生物學通報,2016,43(3):559-566.

[12]Chabi I B,Kayodéa P P,Agbobatinkpo B P,et al. Use of response surface methodology to optimize the drying conditions of a bioactive ingredient derived from the African opaque sorghum beer[J]. African Journal of Biotechnology,2016,15(40):2234-2242.

[13]王建,羅紅霞,于佳弘,等. 響應面法優化復合乳酸菌培養條件[J]. 中國釀造,2016,35(2):66-69.

[14]Soni P,Singh M,Kamble A L,et al. Response surface optimization of the critical medium components for carbonyl reductase production by Candida viswanathii MTCC 5158[J]. Bioresource Technology,2007,98(4):829-833.

[16]李曼,羅晨,張柏林. 應用交叉拮抗法篩選產細菌素菌株的實驗研究[J]. 乳業科學與技術,2008,31(4):157-159.

OptimizationofantibacterialeffectofcomplexlacticacidbacteriaonPseudomonasfluorescensbyresponsesurfacemethodology

SUNMeng-tong1,MAHuan-huan1,LVXin-ran2,LINYang1,BAIFeng-ling1,*,LIJian-rong1,SONGQiang3

(1.College of Food Science and Technology,Bohai University;Food Safety Key Lab of Liaoning Province,National & Local Joint Engineering Research Center of Storage,Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products,Jinzhou 121013,China;2.College of Biology Science and Technology,Beijing Forest University,Beijing 100083,China;3.Dalian Donglin Food Co.,Ltd.,Dalian 116101,China)

Objective:To optimize an efficient complex lactic acid bacteria(LAB)with strong antagonistic activity againstPseudomonasfluorescens. Methods:The complex LAB strains with synergic and antagonistic effects againstP.fluorescenswere screened using the method of Oxford cup agar diffusion. The complex LAB were optimized by response surface methodology. Results:The best inhibitory complex ofLactobacillusplantarumDY4-2,Lb.sakeiYP4-5 andLb.sakeiLY1-6 were screened from 11 groups of complex LAB againstP.fluorescens,and the inhibitory zone diameter reached 25.29 mm,which was higher 2.93,4.80 and 5.35 mm than strain DY4-2,YP4-5 and YP1-6 respectively.Three-factor-three-level experiments designs were developed by Box-Behnken,and the inhibitory zone diameter was used as the responsive values. The bacterial suspension of strain DY4-2,YP4-5 and YP1-6 combined with the ratio of 2∶3∶1,culture temperature 25 ℃ and culture time 48 h,which the inhibitory zone diameter againstP.fluorescenswas 25.84 mm in the optimum conditions. Conclusion:The complex LAB can largely increase the synergy between the strain and the inhibitory activity againstP.fluorescens,which can provide theoretical basis for the research and development efficient LAB biopreservation control ofP.fluorescensin aquatic products spoilage.

complex lactic acid bacteria;Pseudomonasfluorescens;antibacterial activity;response surface method;optimization

2017-02-14

孫夢桐(1992-)，女，碩士研究生，研究方向：食品安全與質量控制，E-mail：daysunmengtong@163.com。

*通訊作者:白鳳翎(1964-)，男，博士，教授，研究方向：食品安全與質量控制和食品微生物學，E-mail：baifling@163.com。

遼寧省科技廳攻關項目(2015103020)；泰山學者藍色產業領軍人才團隊支撐計劃項目 ( 魯政辦字(2015)19號)。

TS201.3

:A

:1002-0306(2017)17-0119-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.17.023