低聚半乳糖對植物乳桿菌生長及部分代謝的影響

, ,

(東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150030)

低聚半乳糖對植物乳桿菌生長及部分代謝的影響

孫思睿,張晟,孟祥晨*

(東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150030)

以一株能產細菌素的植物乳桿菌KLDS1.0391為研究對象,將MRS培養基中的葡萄糖用等量的低聚半乳糖替代,采用體外發酵方式,研究37 ℃培養36 h過程中活菌數、pH和滴定酸度的變化,同時分別測定培養28 h和24 h時有機酸和細菌素的產量。結果表明:隨培養時間的延長,培養物的pH先迅速下降,至12 h后下降速度逐步平穩,以低聚半乳糖作為碳源時促生長作用顯著高于葡萄糖(p<0.05),且菌體衰退較為緩慢。而且該菌株代謝低聚半乳糖時所產生的有機酸及抑菌活性均更高,其中有機酸主要為乳酸、乙酸和丙酸。

植物乳桿菌,增殖,有機酸,細菌素

植物乳桿菌屬于乳桿菌屬,大都從植物中分離獲得,有廣泛用途。植物乳桿菌KLDS1.0391是一株分離自內蒙古天然發酵乳制品——焦克的乳酸菌,經鑒定后,保藏于國家工業微生物菌種保藏中心(CGMCC No.3151)。該菌對模擬消化道環境具有較好的耐受性,也有良好的益生特性[1],能代謝合成細菌素,該細菌素耐酸耐熱性能良好,對G+和G-細菌的生長均具有較強的抑制作用[2]。低聚半乳糖(Galactooligosaccharides,GOS)由半乳糖與葡萄糖主要經β-1,6糖苷鍵連接而成,是一種益生元,在上消化道不能被消化吸收,可作為持續碳源[3],在下消化道促進乳桿菌和雙歧桿菌增殖,維持菌群平衡,改善腸道環境[4]。

目前關于植物乳桿菌利用低聚糖的研究,主要是將低聚糖作為全部或部分碳源,進而分析其促生長作用及相關益生特性。向培養基中添加一定量的水蘇糖可促進植物乳桿菌RB1的增殖作用[5];很多時候,與相同濃度的葡萄糖相比,適量添加低聚糖對儲藏期內或者極酸性胃液環境下的菌體能起到很好的保護作用[6]。除此之外,植物乳桿菌C88與人參多糖的聯合可顯著調節抗氧化活性和免疫調節活性[7],而植物乳桿菌Sc52和牛蒡低聚果糖的聯合則能明顯地改善和治療Ⅱ型糖尿病[8]。

對于能產生細菌素的乳酸菌,低聚糖不僅可以促進其生長,還可以影響細菌素的合成量。已經發現:碳源、氮源組成以及磷酸鹽濃度等[9]都顯著影響乳酸鏈球菌素nisin的合成,菊糖刺激副干酪乳桿菌CMGB16分泌細菌素[10],也有實驗表明:低聚糖可以有效地調節微生物的生長,同時刺激細菌素的產生[11],但是低聚糖、菌株的個體差異性會導致產生不同的效果,而且尚不清楚具體機制。

低聚半乳糖是目前唯一一種能夠被八大有益菌利用的低聚糖,前期在比較不同低聚糖對植物乳桿菌代謝影響時,發現:低聚半乳糖對植物乳桿菌促生長作用最強,但是還不清楚植物乳桿菌KLDS1.0391對低聚半乳糖的代謝特點以及低聚半乳糖如何影響該菌細菌素合成。因此,本研究將以植物乳桿菌KLDS1.0391為研究對象,進一步研究其對低聚半乳糖的代謝特點。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)KLDS1.0391 東北農業大學教育部乳品科學重點實驗室分離保藏;枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)ATCC6633 購自中國藥品生物制品檢定所;MRS培養基:配制方法參照文獻[12];改良MRS培養基(modified MRS,mMRS):將MRS培養基中的葡萄糖用等量的低聚半乳糖代替,其余成分均相同;營養肉湯培養基:蛋白胨10 g,牛肉膏5 g,氯化鈉10 g,蒸餾水1 L。pH調至7.4;標準酸(乳酸、乙酸、丙酸)色譜純 Sigma公司;濃硫酸 天津化學試劑一廠;低聚半乳糖 上海源葉生物(S11138-100 g,BR,98%);過氧化氫酶 Sigma公司。

高效液相色譜儀Waters2695 Waters公司;色譜柱HPX-87H,BIO-RAD;微孔濾膜0.22 μm MILLIPORE公司;KQ-800GKDV超聲波水浴儀 昆山市超聲儀器有限公司;LGJ-1冷凍干燥機 上海醫用分析儀器廠;GL-21高速冷凍離心機 上海市離心機械研究所;Delta320pH計 瑞士梅特勒托利多有限公司;HVE-8D全自動高壓蒸汽滅菌鍋 日本HIRAYAMA公司。

1.2實驗方法

1.2.1 菌株的活化與培養 將于-80 ℃冰箱中保藏的植物乳桿菌KLDS1.0391和枯草芽孢桿菌ATCC6633分別在MRS培養基和營養肉湯培養基中活化傳代3次后,置于37 ℃恒溫箱中培養16 h,以備后續實驗使用。

1.2.2 活菌數的測定 采用平板菌落計數法[13],選取適宜的稀釋梯度,計算其不同生長時期的活菌數。

1.2.3 pH及滴定酸度測定 分別采用pH計直接測定pH和氫氧化鈉滴定法測量滴定酸度。

1.2.4 有機酸含量測定 通過高效液相色譜法測定培養物中乳酸、乙酸和丙酸的含量。

色譜條件:流動相5 mmol/L硫酸,在使用前進行超聲處理30 min,參數設定為流速0.5 mL/min,柱溫55 ℃,進樣量20 μL。取發酵液經離心過濾膜后注射于樣品瓶中待測。

標準曲線的繪制:精確配制不同濃度梯度的標準樣品,經HPLC確定出各標準品的保留時間,并繪制標準曲線。

1.2.5 抑菌活性的測定 先將培養至一定時間的菌液離心得到無細胞發酵上清液,隨即用6 mmol/L氫氧化鈉溶液將pH調至6.5來排除有機酸的干擾,并向上清液中添加已配制好的過氧化氫酶乙酸鈉溶液,于37 ℃水浴鍋中水浴2 h以排除過氧化氫的干擾。處理后的上清液過濾膜后冷凍干燥,用無菌水將凍干樣品復溶,采用雙層平板打孔法測定抑菌活性[14]。

1.2.6 低聚半乳糖對植物乳桿菌生長的影響 將植物乳桿菌以2%的接種量分別接種到MRS和mMRS培養基中,在37 ℃下培養36 h,并每隔4 h取樣一次,進行菌落計數,繪制出該菌株的生長曲線,同時計算對數生長期的生長速率。

1.2.7 植物乳桿菌代謝低聚半乳糖產生有機酸分析 根據滴定酸度曲線,取培養至28 h的酸度恒定時的上清液經一系列處理后進行HPLC分析,測定主要有機酸的種類及產量。標準樣品的標準曲線以標準樣品的濃度為橫坐標,峰面積值為縱坐標[15]。

1.2.8 植物乳桿菌代謝低聚半乳糖產細菌素分析 通過課題組的前期研究[16],當培養至24 h左右細菌素的產量基本趨于穩定,因此在本實驗中選擇該時間點來比較該菌株在兩種培養基中抑菌活性的強弱。

1.3數據分析

每個實驗均獨立重復3次,實驗結果用“平均值±標準差”表示,采用SPSS 17.0對結果進行顯著性差異分析。

2 結果與分析

2.1植物乳桿菌KLDS1.0391在含低聚半乳糖MRS培養基中的生長

植物乳桿菌KLDS1.0391分別以低聚半乳糖和葡萄糖作為碳源時,培養36 h的生長情況見圖1。

圖1 植物乳桿菌在兩種含糖培養基中生長情況Fig.1 The growth of Lactobacillus plantarum in two sugar-containing medium

從圖中可以看出,植物乳桿菌KLDS1.0391在MRS培養基中生長時,無明顯遲滯期,0～4 h生長速度較快,并于培養12 h時活菌數最高,達1.64×109CFU/mL,隨后數量逐漸減少,其在對數期的生長速率為0.6245 h-1。而在含低聚半乳糖的mMRS培養基中,雖然有較為明顯的適應期,但進入對數期后生長速率較MRS培養基快,為0.7271 h-1,并在培養20 h時活菌數最高為5.5×109CFU/mL。此外,在mMRS中衰亡期開始時間晚于對照組,且其衰亡速度與MRS培養基相比也較為緩慢。至培養結束時,在MRS培養基和mMRS培養基中的活菌數分別為:3.4×108CFU/mL和1.42×109CFU/mL。此結果說明:低聚半乳糖對植物乳桿菌KLDS1.0391不僅有明顯的促增殖作用,且在含低聚半乳糖培養基中生長的菌體衰亡更為緩慢。

2.2植物乳桿菌在含低聚半乳糖培養基中生長時pH及滴定酸度的變化

植物乳桿菌分別在MRS和mMRS培養基中培養36 h過程中的產酸情況見圖2。

圖2 植物乳桿菌在兩種含糖培養基中的產酸情況Fig.2 The acid production of Lactobacillus plantarum in two sugar-containing medium

MRS和mMRS培養基初始pH為5.48,接菌培養后,隨著培養時間的延長,pH迅速降低,滴定酸度快速升高,并于培養16 h后產酸變化速度逐漸變緩,在培養至28 h時產酸量趨近穩定,此時pH分別為3.66和3.61,滴定酸度為210.276 °T和224.136 °T。在整個培養期間,兩實驗組滴定酸度及pH變化無顯著差異(p>0.05)。

2.3植物乳桿菌在不同培養基中生長時產生的主要有機酸

植物乳桿菌分別在MRS和mMRS培養基中培養至穩定期28 h,取培養上清液,處理后采用高效液相色譜法測定乳酸、乙酸和丙酸的量,結果見表1。

表1 植物乳桿菌代謝兩種糖產生主要有機酸的量Table 1 The contents of organic acids produced by Lactobacillus plantarum in two sugar-containing medium

注:同行數據字母不同表示差異顯著(p<0.05)。

實驗發現:植物乳桿菌代謝低聚半乳糖后,所產生的乳酸、乙酸和丙酸均顯著高于代謝葡萄糖時所產生的量,且代謝產生有機酸中乳酸量最高,其次是乙酸和丙酸。

2.4低聚半乳糖對植物乳桿菌KLDS1.0391抑菌活性的影響

植物乳桿菌KLDS1.0391在mMRS和MRS培養基中生長24 h后,所產細菌素的抑菌圈分別為(11.41±0.03) mm和(10.38±0.02) mm(p<0.05),說明該菌株在含低聚半乳糖培養基中生長時,更利于其細菌素的合成。

3 討論

無論是體外還是體內實驗,都證實低聚糖對乳桿菌具有良好的促增殖作用,且相比之下,低聚半乳糖的效果最優[17],本實驗也證實了低聚半乳糖對植物乳桿菌KLDS1.0391有促增殖作用,同時延緩其衰亡速度。

乳酸菌是一類可以發酵碳水化合物從而產生大量乳酸的革蘭氏陽性細菌,其代謝產生的有機酸主要為乳酸,其次是各種短鏈脂肪酸,主要包括甲酸、乙酸、丙酸和丁酸。本研究發現植物乳桿菌KLDS1.0391在利用低聚半乳糖后所產生的乳酸、乙酸和丙酸的量都有所提高。不同種屬在不同的發酵時間以及低聚糖添加量不同的情況下,產生有機酸的種類和比例差異較大。例如向干酪乳桿菌的培養基中添加0.5%低聚果糖(F)、1.5%低聚果糖(F)、3%低聚果糖(F)和0.5%葡萄糖(G),在培養的任意時間段,乳酸產量均是低聚果糖培養基高于葡萄糖培養基;而就乙酸而言,不同時間段四種培養基中乙酸產量多少的排列順序各不同,并不是低聚果糖培養基始終高于葡萄糖培養基,例如當培養至8 h時,乙酸產量依次為1.5% F、0.5% F<0.5% G<3% F[18]。

本實驗中的植物乳桿菌KLDS1.0391是一株能產細菌素的菌株,我們研究發現:該菌株能夠利用低聚半乳糖促進細菌素的合成,但具體機制不清。報道中也有一些乳酸菌不能有效的利用某些低聚糖,這樣它在生長過程中就會遭受到其自身誘導合成細菌素的脅迫[19]。Reminta[20]等人在研究中選用三種低聚糖分別與不同菌株聯合培養,發現菌株LL2在以葡萄糖作為碳源時菌體密度雖為α環狀糊精為碳源時的二倍,但是其抑菌活性明顯低于環狀糊精,且8 h后效價下降明顯,這表明促生長作用強并不一定能促進細菌素的合成。而Muoz等人[21]的研究結果表明某些乳酸桿菌在含低聚果糖的培養基中生長時活菌數以及細菌素的產量均高于在葡萄糖培養基中。細菌素的產生與乳酸菌的生長呈現出一定相關性[22],但是不同乳酸菌的生長曲線以及代謝產生細菌素的規律也會略有差異,這可能是由于菌株不同所產生的個體差異,且研究中所利用的底物低聚糖也不同,因而會造成不同的變化規律。而在本實驗中,低聚半乳糖不僅對植物乳桿菌KLDS1.0391有促生長作用,同時還會促進其細菌素的合成。下一步我們將會深入挖掘其中所涉及的機制。

4 結論

低聚半乳糖對植物乳桿菌KLDS1.0391具有顯著的促生長作用,并且能夠有效延緩該菌株在生長后期的衰亡。植物乳桿菌KLDS1.0391在代謝低聚半乳糖時產生的有機酸量以及抑菌活性均顯著高于葡萄糖,其中所涉及的機理仍有待于進一步研究。

[1]李雪.LactobacillusplantarumKLDS1. 0391 和 KLDS1. 0706 益生潛能的體外評價[D]. 哈爾濱：東北農業大學,2015.

[2]Gong H S,Meng X C,Wang H. Plantaricin MG active against Gram-negative bacteria produced by Lactobacillus plantarum KLDS1. 0391 isolated from “Jiaoke”,a traditional fermented cream from China[J]. Food control,2010,21(1):89-96.

[3]Goderska K,Nowak J,Czarnecki Z. Comparision of growth of Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium Bifidum species in media suplemented with selected saccharides including prebiotics[J]. Acta Scientiarum Polonorum Technologia Alimentaria,2008,7(2):5-20.

[4]Bouhnik Y,Raskine L,Simoneau G,et al. The capacity of nondigestible carbohydrates to stimulate fecal bifidobacteria in healthy humans:a double-blind,randomized,placebo-controlled,parallel-group,dose-response relation study[J]. The American Journal of Clinical Nutrition,2004,80(6):1658-1664.

[5]魏艷,曾小群,潘道東,等.水蘇糖對植物乳桿菌的增菌效果研究[J].中國食品學報,2013(12):103-108.

[6]楊郁,李靜雅,劉小濤,等.低聚糖對植物乳桿菌XC-10的影響研究[J]. 現代農業科技,2016(4):287-288.

[7]王曉慧. 人參多糖聯合植物乳桿菌抗氧化及免疫調節活性研究[D]. 長春：吉林農業大學,2015.

[8]欒暢,王宏偉,何忠梅,等. 植物乳桿菌Sc52聯合牛蒡低聚果糖對Ⅱ型糖尿病模型小鼠的治療作用[J]. 食品科學,2015,36(21):214-220.

[9]Todorov S D,Dicks L M T. Bacteriocin production by Lactobacillus pentosus ST712BZ isolated from boza[J]. Brazilian Journal of Microbiology,2007,38(1):166-172.

[10]Vamanu E,Vamanu A. The influence of prebiotics on bacteriocin synthesis using the strain Lactobacillus paracasei CMGB16[J]. African Journal of Microbiology Research,2010,4(7):534-537.

[11]Patel S,Goyal A. The current trends and future perspectives of prebiotics research:a review[J]. 3 Biotech,2012,2(2):115-125.

[12]李景良,宋達峰,顧青. 植物乳桿菌ZJ316生產細菌素[J]. 微生物學報,2008,48(6):818-823.

[13]馬宇驥,張巖,李鍵,等. 茶多酚對乳酸菌發酵及酸奶品質的影響[J]. 黑龍江畜牧獸醫,2016,11:26.

[14]Nieto-Lozano J C,Reguera-Useros J I,Peláez-Martínez M C,et al. Effect of a bacteriocin produced by Pediococcus acidilactici against Listeria monocytogenes and Clostridium perfringens on Spanish raw meat[J]. Meat Science,2006,72(1):57-61.

[15]Xie R,Tu M,Wu Y,et al. Improvement in HPLC separation of acetic acid and levulinic acid in the profiling of biomass hydrolysate[J]. Bioresource Technology,2011,102(7):4938-4942.

[16]貢漢生. 植物乳桿菌KLDS1.0391所產細菌素的分離純化與部分特性[D].哈爾濱：東北農業大學,2009.

[17]黃婧,辛修鋒. 不同功能性低聚糖的益生元功效比較[J].中國食品添加劑,2009(S1):30-33.

[18]張曉峰,李婉,李文杰,等. 低聚果糖對干酪乳桿菌生長和代謝的影響[J]. 食品工業科技,2015,36(3):363-366.

[21]Munoz M,Mosquera A,Almeciga-Diaz C J,et al. Fructooligosaccharides metabolism and effect on bacteriocin production in Lactobacillus strains isolated from ensiled corn and molasses[J]. Anaerobe,2012,18(3):321-330.

[22]劉書亮,張艾青,田剛,等.植物乳桿菌P158的生長曲線及其細菌素的特性[J].核農學報,2009,23(6):1021-1025.

InfluenceofgalactooligosaccharidesonthegrowthandmetabolismofLactobacillusplantarum

SUNSi-rui,ZHANGSheng,MENGXiang-chen*

(Key Laboratory of Dairy Science,Ministry of Education,Northeast Agricultrual University,Harbin 150030,China)

InLactobacillusplantarumKLDS1.0391 which can produce the bacteriocins,the effect of galactooligosaccharides(GOS)which substituted for glucose in MRS media were studiedinvitrofermentation. The titratable acidity,pH value and amounts of viable bacteria were determined during fermentation of 36 h at 37 ℃ in both of MRS and mMRS(GOS substituted for glucose). The contents of organic acids and bacteriocins were also determined at the cultivation of 28 h and 24 h respectively. The results showed that the pH value decreased rapidly with the cultivation and then changed sloely after cultivation of 12 h,and the growth-stimulating effect of galactooligosaccharides(GOS)was significantly higher than that of glucose(p<0.05),meanwhile the decline was slower. Moreover,the concentrations of organic acids and antimicrobial activity of the bacteriocins in mMRS were higher than that in MRS,and the main organic acids were lactate,acetate and propionate.

Lactobacillusplantarum;proliferation;organic acids;bacteriocins

2017-02-21

孫思睿(1994-)，女，碩士研究生，研究方向：食品微生物，E-mail：siruiSun@126.com。

*通訊作者:孟祥晨(1970-)，女，博士，教授，研究方向：乳品科學及食品微生物，E-mail：xchmeng@163.com。

國家自然科學基金項目(3167101455)。

TS201.3

:A

:1002-0306(2017)17-0095-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.17.019