響應面法分析多酚物質間的協同抗氧化作用

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(天津天獅學院,天津 301700)

響應面法分析多酚物質間的協同抗氧化作用

石艷賓,李景,劉浩

(天津天獅學院,天津 301700)

以DPPH自由基清除率為抗氧化活性評價指標,選擇抗氧化較強的茶多酚、兒茶素、綠原酸、沒食子酸為影響因素,運用響應面法分析多酚物質間的抗氧化協同作用。實驗結果表明,茶多酚、兒茶素、綠原酸、沒食子酸對DPPH自由基清除率的影響非常顯著,影響順序依次為沒食子酸、兒茶素、茶多酚、綠原酸。多酚物質間存在一定的交互作用,但交互作用不顯著(除茶多酚與沒食子酸)。響應面實驗中除了1、13組外,其他復配組合的協同系數SE均小于1,表明多酚物質間的協同抗氧化作用不明顯。

多酚物質,抗氧化,DPPH,響應面

隨著我國食品行業的快速發展,單一抗氧化劑的效果已經不能滿足人們的需求,復配抗氧化劑已成為食品抗氧化劑發展趨勢,協同抗氧化已引起國內外研究的高度關注[1-4]。多酚類物質是一類存在于植物體內的次生代謝物質的混合物,包括黃酮類、單寧類、酚酸類以及花色苷類等物質。多酚物質在清除自由基能力方面表現了較好的抗氧化性[5-7],能與維生素C(Vitamin C,VC)、維生素E、胡蘿卜素等其他抗氧化物在體內一起發揮抗氧化功效[1],已成為具有廣泛開發前景的天然抗氧化劑。茶多酚是茶葉中多酚類物質的總稱,包括兒茶素類、花色苷類、黃酮類、黃酮醇類和酚酸類等,主要功效成分為兒茶素類(主要包括表兒茶素、表沒食子兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯和表沒食子兒茶素沒食子酸酯)。茶多酚及其衍生物具有解毒、抗輻射、抗氧化、抑菌等作用,在《GB 2760-2014食品添加劑使用標準》中已作為典型的抗氧化劑,應用于肉類、油炸、焙烤、飲料、膨化、果醬等多種食品[7-9]。綠原酸是一種生物活性較強的酚型抗氧化劑,被廣泛用于醫藥保健行業,具有抗菌消炎、保肝利膽、清熱解毒、清除自由基及抗脂質過氧化等作用[10-11]。沈維治等[12]在分析桑葉多酚單體的協同抗氧化作用中指出,含有綠原酸的多酚單體組合具有協同抗氧化作用,而不含綠原酸的多酚單體組合則全部表現出拮抗作用。本文選擇茶多酚、兒茶素、表兒茶素、綠原酸、沒食子酸等具有代表性的酚型抗氧化劑,并以VC為對照,以DPPH自由基的清除率為抗氧化活性評價指標,比較這幾種多酚物質的抗氧化能力的大小。運用響應面法[13]及復配溶液協同系數分析多酚物質間的抗氧化協同與拮抗作用,為天然酚型抗氧化劑的深度開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) sigma公司;茶多酚、兒茶素、沒食子酸、綠原酸(純度≥98%) 上海源葉生物科技有限公司;表兒茶素(純度≥98%) 華中海威(北京)基因科技有限公司;維生素C、甲醇為分析純 天津江天化工技術有限公司。

UV1000紫外可見分光光度計 上海天美科學儀器有限公司;AL204分析天平 梅特勒-托利多國際貿易(上海)有限公司。

1.2實驗方法

1.2.2 響應面法分析多酚類物質間的抗氧化作用 在分析比較茶多酚、兒茶素、綠原酸、表兒茶素、沒食子酸清除DPPH自由基能力的基礎上,選擇抗氧化能力較強的茶多酚、兒茶素、綠原酸、沒食子酸為響應面實驗的影響因素,應用響應面法分析多酚物質間的相互作用。由于實驗中考察四種物質的協同抗氧化作用,設置樣品的最大濃度為15 μg/mL,響應面實驗設計因素水平編碼見表1。將四種抗氧化物質配制成樣品溶液濃度為5、10、15 μg/mL,分別取10 mL混合均勻后,依據實驗方法1.2.1測定復配混合液的DPPH自由基清除能力。所有實驗均重復三次,應用SAS9.3進行實驗數據的統計分析,建立多元二次回歸模型,分析多酚物質間的協同抗氧化作用。

表1 Box-Behnken實驗設計因素水平編碼表Table 1 Experimental variables and levels for Box-Behnken design

1.2.3 復配溶液抗氧化協同系數(SE)計算 抗氧化協同系數SE取決于實驗得到的清除率(ESC)和理論計算的清除率(TSC)之間的比率。當SE>1,表示有協同作用;SE<1,沒有明顯的協同作用;實驗清除能力(ESC)的計算如1.2.1所述。協同系數可由如下公式計算[15]:

理論清除能力(TSC)的計算如下:

TSC(%)=(ESC1+ESC2+…+ESCn)-(ESC1×ESC2×…ESCn)/102(n-1)

其中,ESC1,…,ESCn表示單一抗氧化劑的實驗清除率;n代表DPPH自由基評價體系中抗氧化劑的種類。

2 結果與分析

2.1多酚物質抗氧化能力比較

將茶多酚、兒茶素、綠原酸、表兒茶素、沒食子酸、VC配制成系列濃度梯度樣品溶液,依據1.2.1實驗方法,測定各個樣品溶液反應后的吸光度值,計算半數清除率IC50,比較多酚物質清除DPPH自由基能力的大小,結果見圖1和表2。

圖1 不同多酚物質對DPPH自由基的清除率Fig.1 DPPH· scavenging capacity of different polyphenols

樣品茶多酚兒茶素表兒茶素綠原酸沒食子酸VCIC5014.3112.5822.0316.7911.7120.15

由圖1可知,DPPH自由基清除率隨著有效質量濃度的增大而呈現明顯的上升趨勢。但當樣液濃度達到40 μg/mL后,這種現象不明顯且逐漸趨于平緩。以半數清除率IC50為多酚物質抗氧化性能的評價指標,比較茶多酚、兒茶素、表兒茶素、綠原酸、沒食子酸對DPPH自由基清除能力。IC50值越低,表明該多酚物質抗氧化能力越強,反之越弱。由表2可知,茶多酚、兒茶素、綠原酸、沒食子酸的半數清除率IC50值小于對照品VC的IC50值,均具有較強的抗氧化性。

2.2多酚物質間抗氧化作用分析

2.2.1 響應面實驗設計及結果 結合單因素實驗結果,依據表1進行Box-Behnken響應面實驗設計,考察茶多酚、兒茶素、綠原酸、沒食子酸對DPPH自由基清除率的影響,響應面實驗結果及復配溶液協同系數SE值的計算結果見表3。

表3 Box-Behnken實驗結果及SE值Table 3 Experimental results and SE of Box-Behnken design

2.2.2 方差分析 利用軟件SAS9.3對表3中實驗數據進行回歸分析,分析結果見表4。茶多酚(A)、兒茶素(B)、綠原酸(C)、沒食子酸(D)的p值均小于0.0001,表明這四個因素對DPPH自由基清除率的影響非常顯著。各影響因子間存在一定的交互作用,交互作用AD對DPPH自由基清除率的影響顯著,其他各影響因子間的交互作用較小。多酚物質間交互作用由大到小依次為:A與D、B與D、C與D、B與C、A與C、A與B。

2.2.3 回歸模型的建立及抗氧化性分析 對響應面實驗結果進行回歸分析,建立全變量二次回歸模型為:DPPH自由基清除率(%)=19.883+1.432A+1.810B+0.573C+1.832D-0.016A2+0.004AB+0.007AC-0.045AD-0.039B2-0.009BC-0.020BD-0.014C2+0.010CD+0.013D2

由表4可知,模型p<0.0001,表明回歸模型非常顯著;失擬項p=0.1055>0.05,即失擬項不顯著,表明該模型是茶多酚、兒茶素、綠原酸和沒食子酸協同抗氧化分析的適合數學模型。本實驗的校正R2值為0.9771,表明回歸方程的擬合度較好。回歸方程系數的顯著性結果表明:A、B、C、D對DPPH自由基清除率的影響非常顯著,影響順序依次為D、B、A、C;AD、B2對DPPH自由基清除率的影響顯著。所有一次項系數均為正值,表明A、B、C、D對DPPH自由基清除率有正相關性;A與B、A與C、C與D的交互項系數為正值,表明兩因素間對DPPH自由基清除率存在正相關性;A與D、B與C、B與D的交互作用系數為負值,表明其對DPPH自由基清除率存在負相關性。

2.2.4 響應面交互作用分析 應用SAS9.3對表3數據進行分析,并繪制出響應曲面圖2～圖7。隨著多酚物質含量的增加,DPPH清除率也隨著增大。同時,響應曲面的坡度比較陡峭,說明四種多酚物質對DPPH自由基清除率的影響顯著,沒食子酸的清除效果明顯強于茶多酚、兒茶素、綠原酸。整體上，四種酚型抗氧化物質間存在一定的交互作用,但不顯著。響應面實驗設計復配組合中除了1、13組,其他復配組合SE均小于1,可能是由于在質量濃度5～15 μg/mL范圍內,沒食子酸與茶多酚、沒食子酸與兒茶素、兒茶素與綠原酸間存在負相關性。

圖2 A和B對DPPH自由基清除率的影響Fig.2 Influence of A and B on DPPH· scavenging capacity

圖3 A和C對DPPH自由基清除率的影響Fig.3 Influence of A and C on DPPH· scavenging capacity

圖4 A和D對DPPH自由基清除率的影響Fig.4 Influence of A and D on DPPH· scavenging capacity

表4 回歸模型方差與分析Table 4 Analysis of variance for the fitted regression model

圖5 B和C對DPPH自由基清除率的影響Fig.5 Influence of B and C on DPPH· scavenging capacity

圖6 B和D對DPPH自由基清除率的影響Fig.6 Influence of B and D on DPPH· scavenging capacity

圖7 C和D對DPPH自由基清除率的影響Fig.7 Influence of C and D on DPPH· scavenging capacity

注:*表示差異顯著,p<0.05;**表示差異非常顯著,p<0.01。

3 結論

茶多酚、兒茶素、表兒茶素、綠原酸、沒食子酸為典型的酚型抗氧化劑,經比較茶多酚、兒茶素、綠原酸、沒食子酸清除DPPH自由基能力高于對照品VC。利用響應面法及復配溶液協同系數分析四種物質間的協同抗氧化作用。茶多酚與兒茶素、茶多酚與綠原酸、綠原酸與沒食子酸對DPPH自由基清除率存在正相關性,沒食子酸與茶多酚、沒食子酸與兒茶素、兒茶素與綠原酸對DPPH自由基清除率存在負相關性。鑒于茶多酚與沒食子酸、沒食子酸與兒茶素、兒茶素與綠原酸在濃度為5～15 μg/mL間存在負相關性,響應面實驗中除了1、13組,其他響應面實驗復配協同系數SE均小于1。實驗設計中有效質量濃度較低,且涉及四種物質間DPPH清除效果的相互作用,研究結果還不能完全揭示出茶多酚與多個單體酚間抗氧化的相互作用關系。因此,在以后的研究中將進一步研發酚型抗氧化劑兩者之間、三者之間復配的相互作用關系,為復合型天然酚型抗氧化劑深度開發利用提供理論依據。

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Synergisticantioxidantactivityamongpolyphenolsbyresponsesurfacemethodology

SHIYan-bin,LIJing,LIUHao

(Tianshi College,Tianjin 301700,China)

DPPH free radical clearance was used as the evaluation index of antioxidant activity. Because tea polyphenols,catechins,chlorogenic acid and gallic acid had stronger antioxidant,they were selected as influencing factors. The synergistic antioxidant activity of the mixture of polyphenols was analyzed by the response surface methodology. Tea polyphenols,catechins,chlorogenic acid,gallic acid had significant effect on the capacity of scavenging DPPH free radicals. The capacity of scavenging DPPH free radicals was as follows:gallic acid,catechin,tea polyphenols,chlorogenic acid. There were interactions between polyphenols,but the interaction was not significant for the capacity of scavenging DPPH free radicals(except gallic acid and tea polyphenols). Except the first experiment and the thirteen experiment,the collaborative SE of other response surface experiments were less than 1,and the synergy of polyphenols was not obvious.

polyphenols;antioxidant activity;DPPH;response surface methodology

2017-02-21

石艷賓(1977-)，女，碩士，高級工程師，研究方向：天然產物開發與應用，E-mail:sybst2003@126.com。

TS201.1

:A

:1002-0306(2017)17-0061-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.17.012