PI因子結構類似物對恰塔努加鏈霉菌發酵產納他霉素的影響

,,

(沈陽農業大學食品學院,遼寧沈陽 110866)

PI因子結構類似物對恰塔努加鏈霉菌發酵產納他霉素的影響

寇美辰,唐欣影,魏寶東*

(沈陽農業大學食品學院,遼寧沈陽 110866)

以恰塔努加鏈霉菌(StreptomycesChattanovgensis)為發酵菌種,向發酵培養基中添加PI因子結構類似物,經過初篩,獲得能正向調控納他霉素發酵產量的PI因子結構類似物;應用Box-Behnken設計建立單因素與納他霉素產量之間的回歸模型,經由響應面分析得到最優組合條件。實驗結果表明:1,2-丙二醇、丙三醇和三乙醇胺都能有效提高納他霉素的發酵產量,向每50 mL培養基中添加0.42 mL 1,2-丙二醇、0.43 mL丙三醇、1 mL三乙醇胺,發酵時間為120 h時,發酵培養基中納他霉素的產量為2.5 g/L,是空白對照組(1.567 g/L)的1.60倍。由此可知一定添加量的PI因子結構類似物可以提高納他霉素產量。

PI因子,恰塔努加鏈霉菌,納他霉素,發酵,響應面分析

納他霉素(Natamycin)是由恰塔努加鏈霉菌(S.chattanovgrnsis)、納塔爾鏈霉菌(S.natalensis)、褐黃孢鏈霉菌(S.gilvosporeus)[1-2]和利迪鏈霉菌(Streptomyceslydicus)[3]等經發酵產生的一種多烯大環內酯類抗生素,由于其廣譜、高效、安全無毒,且對食品風味無不良影響,被廣泛用于食品工業方面[4-5]。但由于納他霉素發酵水平低,成本高,限制了在食品防腐領域的廣泛應用[6]。一直以來,為了提高納他霉素的產量,在菌種選育[7-9]、培養基條件優化[10-11]和發酵工藝優化方面投入了較多研究,而微生物發酵方面涉及較少。

最近在對由S.natalensis發酵生產納他霉素的研究中發現一種新型的自誘導物-PI因子,其結構為2,3-二氨基-2,3-雙(羥甲基)-1,4-丁二醇[12]。當S.natalensis分泌到胞外的PI因子達到50 nm時會引發群感效應,促進納他霉素的合成,并且外源添加PI因子可使PI因子缺失突變菌恢復產生納他霉素的能力[13-14]。通過高效液相色譜法與核磁共振對純化后的PI因子進行凈化、分析,證明含有甘油與乳酸成分,其中甘油有修復npi287缺陷型突變體菌株在液體培養基產生納他霉素的能力[15]。乙二醇、1,2-丙二醇也有相似作用,但已經排除了其作為碳源營養物質的可能性,且多元醇或者乙酸甘油酯或者甘油乳酸酯沒有這種作用。甘油能刺激菌株分泌納他霉素,外源添加甘油能導致缺陷型npi287突變菌株恢復產生納他霉素的能力,但是并不能產生PI因子[16]。而外源添加PI因子與甘油混合物時,納他霉素的產量高于單獨添加PI因子[17]。

由于乙二醇、甘油等PI因子結構類似物對納他霉素的合成有促進作用,而這些化合物共同點是含有氨基或者羥基[18],所以,本實驗以PI因子結構類似物為研究材料,進行對納他霉素發酵影響的初步研究,篩選正調控納他霉素生物合成影響較大的PI因子結構類似物,并通過響應面分析得到優化組合,以期提高納他霉素的發酵產量。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

恰塔努加鏈霉菌(StreptomycesChattanovgensis)ATCC13358 沈陽農業大學食品學院。

61號斜面培養基:可溶性淀粉15.0 g/L、酵母浸粉4.0 g/L、K2HPO40.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、瓊脂15.0 g/L、蒸餾水1000 mL、pH7.4。

PDA培養基:馬鈴薯200.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L、瓊脂15～20 g/L、蒸餾水1000 mL、自然pH。

種子培養基:葡萄糖20.0 g/L、蛋白胨6.0 g/L、酵母浸粉6.0 g/L、蒸餾水1000 mL，pH7.4。

發酵培養基:酵母浸粉5 g/L、葡萄糖40.0 g/L(50%單獨滅菌)、大豆蛋白胨20.0 g/L、蒸餾水1000 mL，pH7.4。

超凈工作臺 上海智城分析儀器制造有限公司;PHS-25數顯pH計 上海雷磁精密儀器廠;手動壓力蒸汽滅菌鍋 上海博訊實業有限公司;電熱恒溫培養箱 南京電器三廠制造;HZQ-F全溫振蕩培養箱 哈爾濱東明醫療儀器廠;紫外分光光度計 南京菲勒儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1 篩選PI因子結構類似物單因素實驗 斜面培養:接種于61號斜面培養基,29 ℃條件下培養恰塔努加鏈霉菌5～7 d;種子培養:用適量無菌水洗下孢子制備成108CFU/mL的孢子懸浮液[19],取適量孢子懸浮液接種到250 mL三角瓶中,29 ℃、搖床轉速為200 r/min的條件下培養恰塔努加鏈霉菌28～42 h;發酵培養:以6%(體積分數)的接種量加到已添加各種PI因子結構類似物的發酵培養基中,在29 ℃、搖床轉速為200 r/min條件下培養恰塔努加鏈霉菌120 h。

分別添加1,2-丙二醇、乙二醇、丙三醇和三乙醇胺[20],在每50 mL的培養基中分別加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2 mL的PI因子結構類似物,發酵培養120 h,以發酵液中納他霉素的發酵產量作為評定指標,通過單因素實驗獲得添加PI因子結構類似物的最適質量濃度。

將篩選后的PI因子結構類似物,以其最適質量濃度加于發酵液中,設定發酵時間分別為12、24、36、48、60、72、84、96、108、120、132 h,以納他霉素的發酵產量作為響應值來確定發酵最優時間。

1.2.2 PI因子結構類似物響應面優化實驗設計 分析單因素實驗結果,將對納他霉素發酵產量影響較大的PI因子結構類似物作后續的響應面分析,運用Design-Expert8.0軟件分析出恰塔努加鏈霉菌發酵體系中PI因子結構類似物的最優組合,實驗設計如表1所示。

表1 Box-Behnken實驗因素和水平Table 1 Independent variables and levels for Box-Behnken design

1.2.3 納他霉素的測定 將發酵液與甲醇以1∶9的比例放于離心管中,充分振蕩,靜置15 min后放入離心機中,8000 r/min離心20 min,用甲醇對上清液進行適當系列稀釋,在303 nm下測定吸光度值,根據吸光度和標準曲線進行納他霉素的定量分析[21]。

1.2.4 恰塔努加鏈霉菌種子生長曲線的確定 在菌株的生長過程中,每6 h取其干重,測定菌體干重(drycellweight,DCW)[22],以發酵時間做X軸,菌體干重為Y軸繪制種子生長曲線圖。

1.3數據分析

通過SPSS軟件分析計算數據差異顯著性,p<0.05差異顯著,p<0.01差異極顯著;采用Design-Expert8.0軟件進行響應面優化實驗,找到最優組合。

2 結果與分析

2.1確定納他霉素標準曲線

應用紫外分光光度計法法,根據已知濃度的納他霉素標準液繪制標準曲線,以納他霉素的含量為橫坐標(x),對應吸光度值為縱坐標(Y),根據線性回歸方程y=0.1076x-0.0095,由方程的決定系數R2=0.9998可知在1～9 mg/L的范圍內有一定線性關系[23]。

2.2單因素實驗結果

2.2.1 不同PI因子結構類似物對納他霉素產量的影響 本實驗將選擇4種PI因子結構類似物:1,2-丙二醇、丙三醇、乙二醇、三乙醇胺,分別向每50 mL發酵液中添加0.4 mL的各PI因子結構類似物進行實驗,篩選出對納他霉素產量影響較大的PI因子結構類似物。

從圖1可以看出,相比于對照組1.567 g/L,添加1,2-丙二醇、丙三醇、乙二醇、三乙醇胺后納他霉素的發酵產量分別為2.02、2.03、1.674、.788 g/L。這四種PI因子結構類似物均能夠提高納他霉素的發酵產量,但提高程度有所差異,其中1,2-丙二醇、丙三醇的效果較好。用SPSS軟件進行分析1,2-丙二醇與丙三醇差異顯著(p<0.05),三乙醇胺與1,2-丙二醇、丙三醇差異極顯著(p<0.01),即本實驗中四種PI因子結構類似物在添加量為0.4 mL時對納他霉素均有促進作用,但各自正調控程度有所不同,原因可能是受氨基和羥基結構以及數量的影響,具體原因需要進一步探究。

圖1 不同的PI因子結構類似物對納他霉素產量的影響Fig.1 Effects of different PI factor structural analogues on natamycin production

2.2.2 不同添加量的PI因子結構類似物對納他霉素產量的影響 從圖2可以看出,在添加范圍內,納他霉素產量隨PI因子結構類似物濃度的升高而升高,在每50 mL培養基中添加0.4 mL 1,2-丙二醇時,納他霉素產量達到2.02 g/L;添加丙三醇0.4 mL時,其產量較高達到2.23 g/L;添加乙二醇0.4 mL時,產量達到1.674 g/L;添加三乙醇胺1 mL時,產量達到1.788 g/L。但當PI因子結構類似物濃度繼續升高時,卻不利于納他霉素的合成,說明此體系中應該存在PI因子結構類似物的最適質量濃度。

圖2 不同添加量的PI因子結構類似物對納他霉素產量的影響Fig.2 Effects of different concentrations of PI factor structural analogues on natamycin production

實驗中所采用的這4種PI因子結構類似物都能夠增加納他霉素的產量,原因可能是其結構中含有的氨基或者羥基在恰塔努加鏈霉菌次級代謝過程中引發了群感效應[18],正調控納他霉素的生成,具體原因尚未明確,需要進一步的研究。根據實驗結果,將運用響應面法把含有氨基結構的三乙醇胺和1,2-丙二醇與丙三醇作后續響應面分析。

2.2.3 發酵時間對納他霉素產量的影響 分別向每50 mL發酵液中添加0.4 mL的3種PI因子結構類似物,從圖3中可以看出,發酵時間在60 h之前,納他霉素的發酵產量都在提高,但上升幅度比較平緩;發酵時間在60～120 h納他霉素的發酵產量大幅上升,發酵到120 h時均達到最高值;之后逐漸趨于平緩,到132 h時均無明顯變化，可能是由于后期發酵時菌體過多,氧氣與營養物質供給不上導致120 h以后的納他霉素產量沒有繼續升高。

圖3 發酵時間對納他霉素產量的影響Fig.3 Effect of fermentation time on natamycin production

2.3響應面法優化實驗結果

2.3.1 Box-Behnken實驗設計及結果 在單因素實驗的基礎上,確定因素和水平[24],選取三乙醇胺(A)、丙三醇(B)、1,2-丙二醇(C)作為實驗因素,分別設計3種水平[25],以納他霉素的發酵產量作為評價指標(Y),采用Box-Behnken實驗設計對發酵體系中添加的PI因子結構類似物進行優化,實驗的設計及結果如表1和表2所示。

表2 Box-Behnken實驗設計及結果Table 2 Box-Behnken design and results

2.3.2 回歸模型的建立及統計分析 根據表1的結果,建立納他霉素的發酵產量對3因素的線性回歸方程:Y=2.48+7.500E-0.03A+0.4B+0.09C-0.03AB-0.02AC-0.04BC-0.07A2-0.087B2-0.15C2。實驗數據結果見表3。

表3 回歸方程的統計分析Table 3 Statistical analysis of the fitted regression equation

注:*.差異顯著(p<0.05);**.差異極顯著(p<0.01)。

圖4 不同因素間的響應面和等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots of different factors

從圖4可以看出,在固定其他發酵參數條件下,當1,2-丙二醇一定時,納他霉素的發酵產量隨著三乙醇胺和丙三醇質量濃度的升高呈現先升高后降低的趨勢,曲面圖中的穩定點即極大值點,說明存在最適質量濃度。統一其他發酵參數,當丙三醇一定時,納他霉素的產量隨著三乙醇胺和1,2-丙二醇的增加呈先增加后減少的趨勢,達到頂峰后減小,等高線圖形近似橢圓形,說明兩自變量間交互效應明顯。當三乙醇胺一定時,另兩種物質的濃度交互作用對納他霉素的產量有顯著的影響,當1,2-丙二醇在0.4 mL以下,納他霉素的發酵產量升高,當1,2-丙二醇的濃度大于0.4 mL時,納他霉素的發酵產量開始降低,當丙三醇濃度為0.42 mL時,產量達到最高值。PI因子中含有兩個氨基和四個羥基結構,當我們外源復合添加這三種PI因子結構類似物時,相當于同時加入了羥基與氨基,可能正好滿足了PI因子發生群感效應的條件,促使納他霉素產量提高,具體原因仍需進一步研究。

從響應面圖形上可以直觀地看出各參數的最優值和各參數之間的交互作用,從圖4中可以較明顯的看出各因素之間的交互作用對納他霉素發酵產量的影響,經分析在響應值達到最高點時[26],添加量為每50 mL培養基加入1,2-丙二醇0.42 mL、丙三醇0.43 mL、三乙醇胺1 mL。此時搖瓶中納他霉素的發酵產量最高,預測值為2.5 g/L。將已經確定的各物質濃度加入發酵培養基中,進行發酵培養,平行實驗三次,最終得到納他霉素的產量2.48、2.50、2.51 g/L。與預測數值接近,表明此模型能夠較好地說明實驗情況。

3 結論

通過單因素實驗對4 種不同PI因子結構類似物進行篩選,得知1,2-丙二醇、丙三醇和三乙醇胺均能正調控納他霉素的合成。通過Design-Expert8.0軟件進行響應面分析得到此發酵體系中的最優配比:添加量為每50 mL培養基加入丙三醇為1,2-丙二醇為0.42、0.43 mL、三乙醇胺為1 mL。在這種發酵培養基的條件下產量大值可達到2.5 g/L,為實驗組的(1.567 g/L)的1.60倍。

[1]喬春明,劉坤,葛菁萍,等.發酵液中納他霉素的生物檢測法[J].食品科學,2009,30(7):159-161.

[2]Saleem M,Rahman A,Afza N.Natamycin treatment of experimental Candida albicans induced keratomycosis in rabbits[J].West Indian Medical Journal,2007,56(6):526-529.

[3]Atta HM,Elsayed AS,Eldesoukey MA,et al. Biochemical studies on the Natamycin antibiotic produced by Streptomyces lydicus:Fermentation,extraction and biological activities[J]. Journal of Saudi Chemical Society,2012,19(4):360-371.

[4]劉婷,吳道澄.食品中納他霉素的使用及其分析方法[J]. 中國調味品,2012,37(11):13-15.

[5]孫志豪.恰塔努加鏈霉菌納他霉素生物合成途徑特異性調控機制研究[D].杭州:浙江大學,2013.

[6]魏寶東,潘婭慧,王亞男,等.促進納他霉素合成的真菌誘導子篩選及誘導條件優化[J].食品科學,2014,34(7):196-200.

[7]喬春明.納塔爾鏈霉菌(Streptomycesnatalensis)產納他霉素高產菌株的選育[D].哈爾濱:黑龍江大學,2008.

[8]鄔建國,王敏,楊東靖.高產納他霉素的褐黃孢鏈霉菌選育[J].中國抗生素雜志,2004,29(6)332-334.

[9]Enriquez LL,Mendes MV,Anton N,et al.An efficient gene transfer system for the pimaricin ProducerStreptomycesnatalensis[J].Fems microbiology letters,2006,57(2):312-318.

[10]Farid MA,Enshsay HA,Ediwany AL,et al.Optimization of the cultivation medium foir natamycin production byStreptomycesnatamysis[J].Journal of Basic Microbiology,2000,40(3):157-166.

[11]Enshsay HA,Farid MA,Esayed EA.Inflence of inoculums type and cultivation conditions on natamy production byStreptomycesnatalensis[J].Journal of Basic Microbiology,2000,40(5/6):333-342.

[12]Recio E,Colinas A,Rumbero A,et al.PI factor,a novel type quorum-sensing Inducerelicits pimaricin production inStreptomycesnatalensis.Journal of Biological Chemistry,2004,279:41586-41583.

[13]Anton N,Mendes MV,Martin JF,et al.Identification of PimR as a positive regulator of pimaricin biosynthesis inStreptomycesnatalensis[J].Bacteriol,2004,186(9):2567-2575.

[14]Martin JF,Aparicio JF.Enzymology of the polyenes pimaricin and candicidin biosynthesis. Methods in Enzymology,2010,459(B):215-242.

[15]Eliseo R,Ararcio JF,Angel R,et al.Glycerol,ethylene glycol and propanediol elicit pimaricin biosynthesis in the PI-factor-defective strainStreptomycesnatalensisnpi287 and increase polyene production in several wild-type actinomycetes[J]. Microbiology,2006,152(10):47-56.

[16]Min L,Shouwen C,Junhui L,et al.Propanol addition improves natamycin biosynthesis of Streptom Yces natalensis[J].Applied Biochemistry&Biotechnology,2014,172(7):3424-3432.

[17]Eliseo Recio,Jesus F Aparicio.Glycerol,ethylene glycol and propanediol elicit pimaricin biosynthesis in the PI-factor-defective strainStreptomycesnatalensisnpi287 and increase polyene production in several wild-type actinomycetes.[J]. Microbiology,2006,152,3147-3156.

[18]Vicente CM,Santos J,Guerra SM,et al.PimT,an amino acid exporter controls polyene production via secretion of the quorum sensing pimaricin-inducer PI-factor inStreptomycesnatalensis[J]. Microbial Cell Factories,2009,8(1):1-13.

[19]高玉榮,王雪平.天然抗真菌食品生物防腐劑-納他霉素的性質及在食品中的應用[J].農產品加工,2009(5):7-9.

[20]Eltiseo R,Angel C,Angel R,et al.PI factor,a novel type quorum-sensing inducer elicits pimaric In production inStreptomycesnatalensis[J].Journal of Biological Chemistry,2004,279(40):41586-41593.

[21]魏寶東,王亞男,宋曉娣.納他霉素高產菌株的選育[J]. 食品科技,2012(2):20-23.

[22]朱惠,金志華,岑沛霖.納他霉素產生菌基因組重排育種[J].中國抗生素雜志,2006,31(12):739-742.

[23]程良英.納他霉素高產菌株的構建及其發酵工藝優化[D].杭州:浙江大學,2010.

[24]Joshi S,Desai Y A J.Application of response-surface methodology to evaluate the optimum medium components for the enhanced production of lichenysin by Bacillus licheniformis R2[J]. Biochemical Engineering Journal,2008,41(2):122-127.

[25]Wang Chuyan,Fan Tao,HU Qingguo.Optimization of Fermentation conditions for Mulberry fruit vinegar by response surface methodology[J].Food Science,2013,36(23):233-240.

[26]田志斌,董超,史延茂,等.納豆激酶固態發酵工藝參數的兩種不同設計方法優化[J].食品與發酵工業,2013,39(1):134-141.

InfluencesofPIfactorstructuralanaloguesontheproductionofnatamycinfromStreptomycesChattanovgensis

KOUMei-chen,TANGXin-ying,WEIBao-dong*

(College of Food Science,Shenyang Agricultural University,Shenyang 110866,China)

Preliminary screening was carried out to obtain PI factor structural analogues that can effectively induce natamycin production in the fermentation culture byStreptomycesChattanovgensis.Box-Behnken experimental design was adopted to build regression model between single factor and natamycin production,according the response surface analysis to determine the optimal conditions. The results indicated that 1,2-propanediol,glycerol and triethanolamine effectively increased natamycin production. With volume of 0.42,0.43 and 1 mL for these PI factor structural analogues in 50 mL culture under the condition of 120 h,the yield of natamycin was 2.5 g/L,which was 0.60 times higher than that of the control group.It can be seen that a certain amount of PI factor structural analogues can increase the yield of natamycin.

PI factor;StreptomycesChattanovgensis;natamycin;fermentation;response surface methodology

2016-12-29

寇美辰(1992-)，女，碩士研究生，主要從事微生物發酵研究，E-mail:804779029@qq.com。

*通訊作者:魏寶東(1969-)，男，博士，副教授，研究方向：食品制造與貯藏研究，E-mail:bdwei2003@yahoo.com.cn。

遼寧省科學技術計劃(2014027007)。

TS201.1

:A

:1002-0306(2017)17-0045-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.17.009