丁香乙酸乙酯相抑制LDL中賴氨酸、色氨酸氧化修飾的研究

,,,, ,,4,,,3,4,*

(1.九江學院藥學與生命科學學院,江西九江 332000;2.九江安德和生物科技有限公司,江西九江 332000;3.江蘇大學食品與生物工程學院,江蘇省農產品物理加工重點實驗室,江蘇鎮江 212013;4.江西農業大學食品科學與工程學院,江西省天然產物與功能食品重點實驗室,江西南昌 330045)

丁香乙酸乙酯相抑制LDL中賴氨酸、色氨酸氧化修飾的研究

萬嚴1,2,楊瓊玉1,2,曲文娟1,3,謝麗琴1,郝澍1,2,沈勇根1,4,張良慧1,2,江慎華1,2,3,4,*

(1.九江學院藥學與生命科學學院,江西九江 332000;2.九江安德和生物科技有限公司,江西九江 332000;3.江蘇大學食品與生物工程學院,江蘇省農產品物理加工重點實驗室,江蘇鎮江 212013;4.江西農業大學食品科學與工程學院,江西省天然產物與功能食品重點實驗室,江西南昌 330045)

低密度脂蛋白(LDL)所含的色氨酸(Trp)、賴氨酸(Lys)發生氧化修飾是導致動脈粥樣硬化(AS)形成的重要因素。為反映丁香乙酸乙酯相(EAFC)對LDL氧化過程中Trp、Lys修飾的抑制作用,本文首先對LDL氧化評價孵育體系中氧化劑CuSO4及底物LDL濃度進行優化;進而以熒光為主要指標對這種抑制效果進行了評價。結果表明,選定CuSO4濃度1.25、25 μmol/L與LDL濃度500 μg/mL為配比做后續實驗。20 μg/mL EAFC能抑制Trp降解導致的熒光淬滅,抑制作用顯著高于1 μg/mL陽性對照(2,6-二叔丁基對甲基苯酚,BHT)(p<0.01)。3 μg/mL EAFC能抑制高反應活性醛修飾Lys,10 μg/mL EAFC能顯著抑制Lys與4-HNE共價結合(p<0.01)。15 μg/mL EAFC能有效抑制Lys與MDA交聯,抑制效果強于1 μg/mL BHT。15 μg/mL EAFC能顯著抑制脂褐素形成(p<0.01)。本文為后期解析EAFC抑制LDL氧化修飾作用方式、抑制氧化LDL與清道夫受體之間識別等作用機理提供參考。

丁香,ApoB-100,低密度脂蛋白,色氨酸,賴氨酸

低密度脂蛋白(Low density lipoprotein,LDL)是由脂質和載脂蛋白B-100(Apolipoprotein B-100,ApoB-100)組成的球狀分子,是血液中膽固醇主要載體[1-2]。LDL由74%～79%脂質和21%～26%蛋白組成[2]。LDL極易被氧化修飾產生醛類如4-羥基壬稀酸(4-hydroxynonenal,4-HNE)和丙二醛,(Malondialdehyde,MDA)等,這些產物能氧化修飾LDL的蛋白質(ApoB-100)中相應氨基酸殘基[3-5]。ApoB-100(4536個氨基酸殘基,分子量為513 kDa)是LDL主要的蛋白質成分,為LDL識別受體的配基。每個ApoB-100分子含有357個賴氨酸(Lysine,Lys)殘基及37個色氨酸(Tryptophan,Trp)殘基[2,6]。因Trp具有高熒光量子產率,為蛋白質主要的內在熒光團。LDL氧化修飾導致Trp熒光發生淬滅[7]。同時,LDL脂質過氧化產物容易氧化Lys經一系列生化反應最終導致動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)產生[5,8]。ApoB-100氧化修飾對促進ox-LDL形成及AS具有重要影響。因此,研究天然產物以及功能食品在減輕醛類對LDL中ApoB-100氧化修飾備受關注[9]。

丁香為桃金娘科植物丁香(EugeniacaryophyllataThunb.)的干燥花蕾,為國家公布的藥食兩用植物,是非常有價值的香料及東亞傳統藥物,具有很多藥理功效[10-13]。

由于在ApoB-100氧化修飾過程中,Trp在Ex295/Em330處的熒光發生淬滅。活性醛與Lys發生衍生化,Lys衍化程度越高其熒光光譜變化越明顯[14]。同時,熒光光譜具有高靈敏度、選擇性和多功能性等優勢[15],被廣泛運用于蛋白熒光特性的表征[16]。

實驗室前期研究結果表明,丁香在87種藥食兩用原料中總多酚含量及FRAP值最高、抗氧化能力最強[17]。丁香乙酸乙酯相在其非油類成分中抑制LDL氧化能力最強[18]。Chen等[19]還發現丁香甲醇粗提物能夠有效抑制蛋白氧化修飾作用。Yang 等[14]通過熒光光譜技術發現丁香有效部位能有效抑制LDL氧化過程中共軛二烯(CD)產生、膽固醇降解及Lys游離氨基活性降解。江慎華等[2]發現丁香乙酸乙酯相能有效抑制LDL弱氧化過程中硫代巴比妥酸反應物(TBARS)生產、CD產生、及Lys游離氨基活性降解。但是,丁香乙酸乙酯相在氧化修飾過程中對LDL所含ApoB-100中Lys、Trp氧化修飾的抑制效果尚不清楚。

因此,本文以熒光定量及掃描為指標,評價EAFC抑制LDL氧化修飾過程中Trp降解、Lys修飾的效果,以期為解析EAFC抑制LDL氧化修飾作用方式、抑制ox-LDL與清道夫受體之間識別等作用機理提供參考。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

丁香 江西黃慶仁棧華氏大藥房,批號:1511008,生產日期:2015年11月20號,由江西樟樹天齊堂中藥飲片有限公司分裝,產自廣西。材料買回后高速粉碎、過40目篩后置冰箱中備用。LDL依據江慎華等[2]方法自中分離得到。

肝素鈉、檸檬酸鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉 上海阿拉丁試劑有限公司;其余試劑均為國產分析純或優級純。

日立F-4500熒光分光光度計 日本島津公司;UNIC7200可見分光光度計 尤尼柯(上海)公司;PB-10 pH計 Sartorius儀器設備有限公司;CT15RT型高速冷凍離心機 上海天美生化儀器設備工程有限公司;DFY-C高速粉碎機 溫嶺林大機械公司;RE-52型旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠;LJL10冷凍干燥機 鞏義市予華儀器有限公司;透析袋(SP132544) 上海源葉生物科技有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1 生物活性追蹤法提取EAFC 采用江慎華等[2]方法,稱取200 g丁香干粉,甲醇提取,料液比1∶10 (g/mL)、60 ℃、180 r/min水浴振蕩提取40 min,重復以上操作再次提取,合并兩次提取液、運用旋轉蒸發儀濃縮。取1/10溶液濃縮獲得丁香粗提物。剩余溶液旋轉蒸發儀濃縮后加入濃縮液3倍體積蒸餾水超聲輔助混懸后,向該混懸液液中依次加入石油醚、乙酸乙酯和正丁醇充分萃取(每次溶劑用量200 mL,每種溶劑萃取10次),各萃取相及剩余水相分別濃縮后置于-68 ℃超低溫冰箱預凍過夜后,置冷凍干燥機中凍干,72 h后獲干粉,分裝、密封后置真空干燥器中保存備用。

1.2.2 LDL提取 采用江慎華等[2]方法。在磁力攪拌作用下,將血漿(300 mL)與沉淀液(0.064 mol/L檸檬酸鈉,50000 U/L肝素鈉,5 mol/L鹽酸調pH至5.04)按1∶10體積比混勻。37 ℃水浴靜置15 min后,4 ℃、3000 r/min離心10 min,棄上清。收集沉淀后加入1500 mL洗滌液(0.064 mol/L檸檬酸鈉5 mol/L鹽酸調pH至5.11)洗滌沉淀。離心(10 min 4 ℃ 3000 r/min)棄上清、收集沉淀,用少量磷酸鹽緩沖液(PBS)(160 g/L NaCl、2.7 mmol/L KCl、8.1 mmol/L Na2HPO4、1.5 mmol/L KH2PO4)溶解LDL并于4 ℃透析24 h,每6 h更換一次PBS。以牛血清白蛋白為標準品、按Lowry法[20]測定LDL中蛋白質含量,以該蛋白含量定量LDL濃度,4 ℃避光保存,一周內用完。標準曲線回歸方式為:y(OD)=0.013x(μg/mL)+0.0503,R2=0.9903。

圖1 生物活性追蹤法制備EAFCFig.1 The preparation scheme of EAFC based on bioassay guided method

1.2.3 確定LDL氧化孵育體系中CuSO4及LDL適宜添加量 用PBS將透析后的LDL蛋白濃度稀釋為250、500、1000 μg/mL,分別加入不同濃度氧化劑CuSO4(1.25、2.5、5、10、25、50 μmol/L),37 ℃孵育24 h后,加1% EDTA-Na2終止氧化反應,分別測定脂褐素含量、4-HNE對ApoB-100修飾作用釋放的熒光和Trp熒光強度。以及固定LDL濃度為500 μg/mL,分別加入1.25、2.5、5、10、25、50 μmol/L CuSO4對MDA-Lys和高反應活性醛類修飾Lys及Trp熒光光譜進行掃描。

1.2.4 EAFC對ox-LDL中Trp降解的抑制 設置促氧對照組(4.9 mL LDL+50 μL CuSO4+50 μL甲醇)、空白對照組(4.9 mL LDL+50 μL去離子水+50 μL甲醇)、2,6-二叔丁基對甲基苯酚(2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol,BHT)陽性對照組和不同濃度的EAFC(4.9 mL LDL+50 μL CuSO4+50 μL BHT或EAFC)。LDL的終濃度為500 μg/mL,CuSO4終濃度為1.25、25 μmol/L。37 ℃水浴孵育14 h后進行如下測定。

采用Ferretti 等[21]方法稍加修改,定量測定Ex295nm/Em330 nm處Trp熒光強度以評價各樣液抑制ApoB-100中Trp降解的效果。

采用De 等[8]方法稍加修改,固定Ex280 nm,在300～450 nm發射波長內對各樣品進行熒光掃描。

1.2.5 EAFC對脂質過氧化產物修飾ApoB-100的抑制效果

1.2.5.1 EAFC抑制4-HNE與ApoB-100中Lys的ε-氨基共價結合 采用Itakura 等[22]方法稍加修改。按照1.2.4方法孵育14 h,測定Ex360 nm/Em430 nm處熒光強度,評價LDL氧化過程中4-HNE與ApoB-100中Lys的ε-氨基相互作用形成的熒光強度以及不同樣液的抑制效果。

1.2.5.2 EAFC抑制MDA與ApoB-100中Lys的ε-氨基相互作用 采用Yang等[14]方法,按照1.2.4方法孵育18 h,固定Ex390 nm、在400～550 nm范圍內掃描發射波長,測定LDL氧化過程中MDA與ApoB-100中賴氨酸ε-氨基相互作用形成的熒光強度及不同樣液的抑制效果。

1.2.5.3 EAFC抑制高反應活性醛類對Lys修飾效果 采用Yang 等[14]方法,按照1.2.4方法孵育18 h,固定Ex350 nm、在發射波長400～550 nm內對各樣品進行熒 光掃描。

1.2.5.4 EAFC抑制LDL氧化過程中脂褐素產生 采用Sutherland 等[23]方法稍加修改。按照1.2.4方法孵育14 h,在5 nm狹縫條件下測定Ex350 nm/Em460 nm處熒光強度,測定EAFC對LDL氧化過程中脂褐素產生的抑制效果。

1.2.6 數據處理 采用DPS軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1確定LDL氧化孵育體系中CuSO4及LDL適宜添加量

Cu2+誘導氧化時,LDL中不飽和脂肪酸氧化形成大量脂質過氧化產物[24]。已經證實,在LDL氧化過程中產生的脂質過氧化產物能誘導LDL結構和功能改變[21]。由于不同的LDL以及CuSO4添加量對LDL氧化中各評價體系的結果具有影響[18]。因此,本實驗首先對氧化孵育體系中LDL及CuSO4添加量進行優化,實驗結果如圖2、圖3所示。

2.1.1 確定Trp熒光淬滅、4-HNE與Lys共價結合、脂褐素孵育體系中CuSO4及LDL適宜添加量 ApoB-100是LDL主要的蛋白質成分,在受體介導的內吞作用中作為配基識別LDL受體[6]。ApoB-100分子含有的37個Trp是LDL主要的內在熒光團[2],隨LDL氧化其熒光會發生淬滅[7],該熒光淬滅越多表示LDL蛋白質氧化越嚴重[25]。為確定Trp熒光孵育體系中LDL和CuSO4的適宜添加量,采用1.2.3中方法測定,結果如圖2a所示。當LDL為500 μg/mL時,CuSO4濃度在0～25 μmol/L范圍內,熒光強度隨濃度增強而減弱,在25～50 μmol/L范圍內時,熒光強度隨濃度增強而有所增強。當LDL濃度為250或1000 μg/mL時,CuSO4濃度在0～50 μmol/L范圍內Trp熒光強度均未出現明顯拐點。該結果表明,Trp熒光淬滅的評價體系中LDL和CuSO4適宜濃度分別為500 μg/mL和25 μmol/L。

4-HNE是重要的脂質過氧化產物,其與蛋白質形成的加成物影響蛋白質的結構和功能[26]。通過檢測Ex360 nm/Em430 nm的熒光,可以檢測LDL氧化中4-HNE與Lys結合[20]。脂褐質為氧化和交聯的蛋白質、脂類以及少量碳水化合物組成的復雜混合物[27]。該混合物由醛式的脂質過氧化產物和蛋白質反應生成,在衰老細胞、血漿、ox-LDL以及AS損傷中均有分布,其在血漿中的濃度是體內脂質過氧化標志[23]。為確定4-HNE與Lys共價結合、脂褐素孵育體系中LDL和CuSO4的適宜添加量,采用1.2.3節方法測定結果如圖2b、圖2c所示。當LDL濃度為500 μg/mL時,CuSO4濃度在0～25 μmol/L范圍內,熒光強度隨CuSO4濃度增加而增強,而CuSO4濃度在25～50 μmol/L熒光強度隨Cu2+濃度增加而減弱。而LDL濃度在250、1000 μg/mL時,CuSO4在0～50 μmol/L濃度范圍內氧化程度均未出現明顯拐點。因此,4-HNE與Lys共價結合、脂褐素評價體系中LDL和CuSO4適宜濃度為500 μg/mL和25 μmol/L。

圖2 不同LDL和CuSO4條件下LDL氧化產生的熒光強度Fig.2 The fluorescence intensity of LDL oxidation under different CuSO4 and LDL conditions注:(a)Trp激發熒光;(b)4-HNE與Lys共價結合;(c)脂褐素。

2.1.2 Trp熒光光譜、MDA-Lys、高反應活性醛類修飾Lys孵育體系中CuSO4適宜添加量 天然ApoB-100中Trp熒光光譜在332 nm附近有最大吸收[25],隨著LDL氧化,最大吸收逐漸降低[2]。為進一步驗證2.1.1反應體系中LDL濃度及CuSO4添加量,本文進一步掃描Trp熒光光譜,結果如圖3a所示。當CuSO4在0～50 μmol/L之間時,熒光掃描峰值隨著CuSO4濃度升高而降低。加入25、50 μmol/L CuSO4后Trp熒光光譜幾乎重疊。掃描光譜圖熒光強度及走勢越低,表明LDL氧化越嚴重,添加丁香樣品后更容易反映其抑制效果。圖3a結果在該孵育體系中CuSO4濃度為25 μmol/L比較適宜,驗證了上述圖2a測定結果。

LDL氧化過程中還會產生另一種高反應活性醛(MDA),MDA能與Lys交聯形成MDA-Lys[28-29]。脂質氧化產物-各種醛類修飾Lys的ε-氨基,形成Ex350 nm/Em420 nm處有強熒光吸收的物質,導致蛋白質無法正確折疊乃至降解[6,22]。熒光強度越高,代表LDL氧化修飾越嚴重,添加丁香樣品后更容易反映其抑制氧化修飾效果。因此,分別固定Ex390 nm,Ex350 nm掃描發射波長反映Lys光譜變化,確定MDA-Lys和高反應活性醛類修飾Lys孵育體系中CuSO4的最適濃度。結果如圖3b、圖3c所示。當CuSO4為1.25 μmol/L時,MDA-Lys熒光光譜峰值明顯降低,高反應活性醛類對Lys修飾的光譜峰值明顯升高,隨著CuSO4濃度進一步升高,光譜峰值變化不大。結果表明MDA-Lys和高反應活性醛類修飾Lys的熒光光譜孵育體系中CuSO4的最適濃度為1.25 μmol/L。

圖3 在不同CuSO4濃度條件下500 μg/μLLDL氧化形成的熒光強度Fig.3 The fluorescence intensity of 500 μg/μL LDL oxidation at different CuSO4 concentrations注:(a)Trp熒光光譜;(b)MDA-Lys;(c)高反應活性醛類修飾Lys。

2.2 EAFC對LDL氧化過程中Trp降解的抑制作用

2.2.1 EAFC對LDL氧化過程中Trp降解導致熒光淬滅的定量測定 由上述2.1確定混合孵育體系中LDL和CuSO4最適濃度后,采用1.2.4方法測定EAFC對LDL氧化過程中Trp降解抑制作用的結果如圖4所示。與促氧相比,添加15、20 μg/mL EAFC后Trp熒光強度顯著增強(p<0.01),濃度越高、抑制效果越好,并且20 μg/mL EAFC的抑制效果強于陽性對照(1 μg/mL)(p<0.01)。表明EAFC能有效抑制Trp降解。

圖4 EAFC對LDL氧化過程中Trp熒光淬滅的抑制效果Fig.4 Inhibition efficiency of EAFC on Trp fluorescence quenching 注:不同字母表示差異極顯著,p<0.01,圖6,圖9同。

2.2.2 EAFC對LDL氧化過程中Trp降解導致熒光淬滅的掃描分析 2.2.1中結果表明EAFC能有效抑制Trp熒光淬滅,在此基礎上根據1.2.4方法通過熒光掃描評價各樣品對LDL氧化過程中Trp熒光光譜變化的抑制效果,結果如圖5所示。與促氧相比,添加1 μg/mL EAFC后其熒光光譜最大吸收增強,且隨EAFC濃度升高其最大吸收峰逐漸增強。20 μg/mL EAFC的抑制效果強于1 μg/mL BHT。該結果與圖4定量測定結果相互佐證,進一步證明EAFC能夠有效抑制氧化LDL中Trp降解。EAFC對Trp降解的抑制作用可能是通過抑制Cu2+與ApoB-100結合,從而避免蛋白質的氨基酸殘基被修飾[30]。Ferretti 等[21]研究發現植物甾醇也能抑制LDL氧化過程中Trp降解。

圖5 EAFC對LDL氧化過程中Trp產生熒光光譜變化的影響Fig.5 The influence of EAFC on Trp fluorescence spectroscopy

2.3 EAFC抑制LDL氧化過程中脂質過氧化產物對ApoB-100中Lys的修飾作用

LDL氧化過程中,不僅ApoB-100的Trp會降解,Lys也會受醛類修飾[31]。由2.2結果可知EAFC能有效抑制ApoB-100中Trp降解,本節進一步分析EAFC對脂質過氧化產物修飾ApoB-100中Lys的抑制效果。

2.3.1 EAFC抑制LDL氧化過程中4-HNE與ApoB-100中Lys共價結合效果 LDL經脂質過氧化反應形成的4-HNE是一種能與Lys共價結合的醛類[20]。采用1.2.5.1節方法測定EAFC對4-HNE與Lys共價結合的抑制作用,結果如圖6所示。與空白相比,促氧熒光強度顯著增強(p<0.01)。添加10 μg/mL EAFC后熒光強度較促氧顯著減弱(p<0.01),且隨著EAFC濃度提高,熒光強度逐漸減弱。表明EAFC能有效抑制4-HNE對ApoB-100中Lys的修飾作用,但EAFC的抑制效果顯著低于10 μg/mL BHT。Keller等[32]研究發現仙人掌多酚和黃酮能夠抑制4-HNE的毒性。EAFC抑制4-HNE與Lys共價結合,也可能是由其所含的多酚和黃酮起作用。

圖6 EAFC對4-HNE與Lys的ε-氨基相互作用的抑制效果Fig.6 Inhibition efficiency of EAFC on covalent binding of 4-HNE to the lysine ε-amino group

2.3.2 EAFC抑制LDL氧化過程中MDA與Lys結合作用 由2.3.1分析可知EAFC能有效抑制4-HNE與Lys共價結合(圖6)。LDL脂質過氧化產生的代表性醛類除了4-HNE外,還包含MDA[27]。因此,采用1.2.5.2節方法測定EAFC對MDA與Lys結合的抑制作用結果如圖7所示。與空白相比,促氧組熒光光譜最高。添加5 μg/mL EAFC后,熒光光譜及強度較促氧降低。當EAFC升高到15 μg/mL后,熒光光譜進一步降低,其熒光強度及掃描譜線甚至趨近于空白組,并強于1 μg/mL BHT,表明EAFC也能有效抑制MDA與Lys結合。實驗室前期研究基礎已表明EAFC能有效抑制LDL氧化過程中形成MDA[33]。因此,EAFC可能是通過抑制MDA產生、降低其含量而達到減少MDA與ApoB-100中Lys交聯。

圖7 EAFC對MDA與Lys交聯作用的抑制效果Fig.7 Inhibition efficiency of EAFC on covalent binding of MDA to the Lys

2.3.3 EAFC抑制LDL氧化過程中高反應活性醛類對Lys修飾作用 LDL脂質過氧化中除了會產生2.3.1和2.3.2中的4-HNE和MDA,還包含許多其他的高反應活性醛類[34]。因此,通過1.2.5.3方法測定分析EAFC抑制高反應活性醛類對Lys修飾的效果,結果如圖8所示。與空白相比,促氧的熒光光譜峰值明顯升高。添加3 μg/mL和5 μg/mL EAFC后其熒光光譜峰值逐漸降低。以上結果表明EAFC能減緩LDL氧化過程中高反應活性醛類對ApoB-100中Lys的修飾作用。Picard等[35]研究發現氨基胍能延緩高反應活性醛類對Lys的修飾作用。

圖8 EAFC對高反應活性醛類修飾Lys的熒光光譜的影響Fig.8 Effect of EAFC on fluorescence spectra of lysine by reactive aldehydes modification

2.4 EAFC抑制LDL氧化過程中脂褐素的形成

LDL在氧化過程中,除了ApoB-100中Trp會降解以及醛類會對Lys修飾外,ox-LDL產生的脂質過氧化產物還能與ApoB-100反應生成脂褐素[36]。為此,采用1.2.5.4方法通過測定脂褐素熒光變化反映EAFC對脂質過氧化產物與ApoB-100反應的抑制效果,結果如圖9所示。與促氧相比,添加15 μg/mL EAFC樣液后,其熒光強度顯著降低(p<0.01)。隨著EAFC濃度增加,熒光強度逐漸減弱。這些結果表明,EAFC也能有效抑制ox-LDL中脂褐素生成。王麗麗發現紫丁香葉提取物能抑制脂褐素形成[37]。LDL氧化修飾導致ApoB-100周圍極性發生改變使其更容易與脂質過氧化產物發生反應。EAFC可能是通過保護ApoB-100,使其極性不發生變化,從而使其不易于與脂質氧化產物結合[30]。

圖9 EAFC對LDL氧化過程中脂褐素形成的抑制效果Fig.9 Inhibition efficiency of ethyl acetate extract of clove on lipofuscin generated

3 結論

EAFC能抑制Trp的降解,延緩LDL氧化過程中ApoB-100的修飾,其抑制效果高于1 μg/mL BHT。

10 μg/mL EAFC能抑制4-HNE對Lys的修飾,當EAFC濃度增加為15 μg/mL不僅能抑制脂褐素形成,對于Lys與MDA發生交聯的抑制效果強于1 μg/mL BHT(p<0.01),所以EAFC能抑制高反應活性醛類對Lys修飾,延緩清道夫受體對ox-LDL的識別與吞噬。

EAFC抑制醛類對Lys修飾可能是通過抑制Trp的降解,從而減少脂質過氧化反應的啟動,進而減少醛類對Lys的修飾。

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InhibitioneffectofethylacetatefractionofcloveonTrpandLysmodificationduringLDLoxidation

WANYan1,2,YANGQiong-yu1,2,QUWen-juan1,3,XIELi-qin1,HAOShu1,2,SHENYong-gen1,4,ZHANGLiang-hui1,2,JIANGShen-hua1,2,3,4,*

(1.School of Pharmacy and Life Science,Jiujiang University,Jiujiang 332000,China;2.Jiujiang Andehe Biotechnology Corporation Ltd,Jiujiang 332000,China;3.School of Food and Biological Engineering,Jiangsu University,Jiangsu Provincal Key Lab of Physical Processing of Agricultural Products,Zhenjiang,212013,China;4.College of Food Science and Engineering,Jiangxi Agricultural University,Jiangxi Key Laboratory of Natural Products and Functional Foods,Nanchang 330045,China)

Oxidative modification of Tryptophan(Trp)and Lysine(Lys)in apoB-100 of LDL is the important factor resulting in atherosclerosis(AS). In order to investigate the possible inhibition effect of Ethyl acetate fraction of clove(EAFC)on Trp and Lys oxidative modification during LDL oxidation,the concentrations of CuSO4and LDL were firstly optimized,and then this inhibition effects of EAFC against oxidation were evaluated by using fluorescence as the main index in this paper. The results indicated that the concentrations of CuSO4and LDL were 1.25,25 μmol/L and 500 μg/mL respectively in subsequent experiments. Fluorescence quenching can be inhibited by 20 μg/mL EAFC,and this inhibition effect was significantly higher than that of the 1 μg/mL butylated hydroxytoluene(positive control,BHT)(p<0.01). Likewise,3 μg/mL EAFC can inhibit the modification of Lys residues by highly reactive aldehydes. 10 μg/mL EAFC can dramatically inhibit covalent binding of 4-HNE with the Lys residues(p<0.01). The modification of Lys residues resulting from MDA was inhibited by EAFC(15 μg/mL)which was significant than that of 1 μg/mL BHT. Meanwhile,15 μg/mL EAFC showed a significant inhibition on formation of lipofuscin(p<0.01). This study provides references for further analyzing the inhibition way of EAFC and the mechanism that EAFC inhibits the recognition between ox-LDL and scavenger receptors.

clove;apolipoproteinb-100;low density lipoprotein;tryptophan;lysine

2017-03-06

萬嚴(1993-)，女，碩士，研究方向：天然產物研究與開發，E-mail：wanyanbio@163.com。

*通訊作者:江慎華(1973-)，男,博士，教授，研究方向：天然產物研究與開發,E-mail：jiangshenhua66@163.com。

國家自然科學基金(31360371，31560308，31301423);江西省科技支撐計劃(20151BBF60026);江西省教育廳項目(GJJ161081);江蘇省農產品物理加工重點實驗室開放課題(JAPP2010-5);江西省天然產物與功能食品重點實驗室開放基金、九江學院人才啟動基金、九江學院教改課題(2015-04)。

TS201.4

:A

:1002-0306(2017)17-0010-08

10.13386/j.issn1002-0306.2017.17.003