菠蘿蜜果皮活性成分的純化與結構鑒定

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(中國熱帶農業科學院農產品加工研究所,廣東湛江 524001)

菠蘿蜜果皮活性成分的純化與結構鑒定

彭芍丹,李積華,黃曉兵,林麗靜*

(中國熱帶農業科學院農產品加工研究所,廣東湛江 524001)

為了進一步研究菠蘿蜜果皮中的活性成分,采用柱層析分離方法對菠蘿蜜果皮乙醇提取物進行分離純化,利用硅膠柱、薄層層析和凝膠柱等分離手段,從菠蘿蜜醇提物的乙酸乙酯萃取部位中分離純化并鑒定了2種化合物,經過1H-NMR和13C-NMR核磁共振波譜儀檢測后結構已確定,分別為環木菠蘿烯酮(cycloartenone)和環桉樹醇(cycloeucalenol)。通過本實驗的分離純化工藝,為全面研究菠蘿蜜的植物化學數據提供理論依據。

菠蘿蜜果皮,活性成分,單體,結構鑒定

菠蘿蜜(ArtocarpusheterophyllusLam.),又稱波羅蜜、苞蘿、木菠蘿、樹菠蘿、大樹菠蘿等,是桑科菠蘿蜜亞科菠蘿蜜屬常綠喬木,是世界著名的熱帶水果。自一千多年前從印度引入我國后,被廣泛的種植于我國的廣東省、廣西省、云南省、海南省、福建省和臺灣省等地區,作為“全身都是寶”的熱帶珍果。菠蘿蜜不僅能作為鮮果供人們食用,其樹種更是集藥用和木材于一身的優秀樹種,但是它的利用卻受到了很大的局限性。不同菠蘿蜜品種差異極大,品質低下的部分樹種病害嚴重,再加上果實本身保鮮期極短,我國在其生產上的技術又不夠成熟和完善,在產業規模上就不足以支撐菠蘿蜜加工的發展,在市場上也滿足不了人們對產品數量和質量上的要求。除了菠蘿蜜果干一例較為成功的產品外,沒有其他對菠蘿蜜加工利用的好技術和方法,導致菠蘿蜜在我國也只能成為小眾水果,北方地區根本不能享用到菠蘿蜜果實的香甜。而國內外對于菠蘿蜜的研究報道也不多,因此這方面的研究利用還是很值得開展的。

多項研究表明,菠蘿蜜果實具有很強的抗氧化活性[1],Jagtap通過DPPH、FRAP和DMPD三種方法對成熟菠蘿蜜果肉的丙酮、甲醇、乙醇和水的提取物進行抗氧化活性評價,均證明菠蘿蜜果肉具有很強的清除自由基活性,其中黃酮和多酚是菠蘿蜜果肉的抗氧化物質;Saxena A等用DPPH自由基清除法對氣調保藏菠蘿蜜果肉的甲醇提取物進行抗氧化活性分析,發現經過預處理的果肉具有較好的抗氧化穩定性,其對DPPH自由基的清除率與其中抗壞血酸和多酚含量呈正相關[2-3]。Soong等用ABTS法和FRAP法研究了脫脂后菠蘿蜜種子和果肉的乙醇提取物的抗氧化活性,發現種子的抗氧化活性高于果肉,而且干制后樣品的抗氧化活性約為新鮮樣品的3倍,酚類化合物約貢獻了70%的抗氧化活性[4],烘干后成熟果實的乙醇提取物對DPPH自由基清除活性的IC50為410 μg/mL[5]。對于占整個果實約1/2的菠蘿蜜果皮的抗氧化活性則未見報道,而且已有研究證明了其果皮中黃酮類化合物含量豐富,黃酮類與抗氧化活性有密切的關系,本文作者已在前期實驗的基礎上得出菠蘿蜜果皮醇提物乙酸乙酯部位具有較強抗氧化活性,因此本研究是在前期研究的基礎上對乙酸乙酯活性部位的進一步純化,這對菠蘿蜜的綜合利用有重要意義。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

菠蘿蜜 采于湛江徐聞縣龍塘鎮(九成熟)。

無水乙醇,95%乙醇,鹽酸,甲醇,丙酮,乙酸乙酯,氯仿,石油醚 分析純,國藥集團化學試劑;實驗用水 二次蒸餾水;100～200,200～300目柱層析硅膠、預制薄層層析板 青島海洋化工廠;Sephadex LH-20柱層析凝膠 Pharmacia公司;5%硫酸乙醇顯色劑、碘顯色劑 國藥集團。

超高壓液相-高分辨飛行時間質譜Triple TOFTM 5600+/UPLC-Triple TOF MS/MS 美國AB Sciex公司;AV-600型核磁共振波譜儀 美國Bruker公司;HH-4恒溫水浴鍋 國華電器有限公司;752N紫外可見分光光度計、FA2104N天平 上海精密科學儀器有限公司;真空冷凍干燥機 北京若比鄰公司;LR4002旋轉蒸發儀 德國Heidolph公司;DFT-150高速萬能粉粹機 上海鼎廣有限公司;MS 3 digital振蕩器 德國IKA公司;冰箱 海爾集團有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1 乙酸乙酯部分的分離 即乙酸乙酯部分得到條件為菠蘿蜜果皮在80%乙醇、溫度65 ℃,料液比1∶3條件下提取三次得到的粗提物,再用石油醚、乙酸乙酯、水一次萃取后得到的乙酸乙酯部濃縮浸膏[6-7]。

取乙酸乙酯部分(184 g),使用100～200目硅膠拌樣后進行常壓硅膠柱層析(硅膠100～200目),氯仿-甲醇系統(20∶1～10∶1～8∶1～4∶1～0∶1)梯度洗脫,得到8個流分,依次命名為Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4、Fr.5、Fr.6、Fr.7、Fr.8。

Fr.3分離:取Fr.3部分,進行Sephadex LH-20凝膠柱層析(流動相為氯仿∶甲醇1∶1),得到4個部分。其中第1份有白色狀物質析出,重結晶得到白色固體物質BLM-1(75 mg)。

Fr.8分離:取Fr.8部分,使用100～200目硅膠拌樣后進行常壓硅膠柱層析(硅膠200～300目),氯仿-甲醇系統(1∶0～20∶1～10∶1～4∶1～0∶1)梯度洗脫,得到5個部分。其中第5個部分有白色固體析出,經過反復硅膠純化后得到白色無定形固體BLM-2(約100 mg)。

Fr.1、Fr.2、Fr.4、Fr.5、Fr.6、Fr.7等流分未純化出相應單體物質。另外,Fr.8中還分離出白色細小晶體BLM-3(約200 mg),故本研究以Fr.3和Fr.8作為研究對象。具體分離過程見下圖1。

圖1 乙酸乙酯部分離純化流程圖Fig.1 The flow chart of extraction and purification from the fraction of ethyl acetate

1.2.2 化合物結構鑒定 采用核磁共振1H-NMR和13C-NMR,超高壓液相-飛行時間質譜等現代技術對化合物進行結構分析和解析,結合相關文獻報道最終鑒定各化合物結構。具體方法如下。

顯色反應:乙酸酐-濃硫酸反應(Liebermann-Burchard反應)。取乙醇提取液1～2 mL,揮去乙醇,殘渣溶解或懸浮于乙酸酐中,滴加1滴濃硫酸,如呈紫紅色,并且在溶液上層逐漸變綠,證明含有甾體、三萜類或皂甙。

色譜條件:色譜柱:ZORBAX Eclipse Plus C18(100 mm(2.1 mm,1.8 μm);流動相:乙腈(A)和水(B);流速0.3 mL/min;柱溫40 ℃;進樣量2 μL;梯度洗脫程序:0.0～2.0 min,10%～95% A;2.0～15.0 min,95% A。

質譜條件:通過全掃描獲得一級譜圖,并通過數據采集模式獲得二級譜圖。電噴霧離子源(ESI)負離子模式;質量掃描范圍100～1000 m/z;離子源霧化氣:55 Psi;輔助加熱氣:55 Psi;氣簾氣:40Psi;輔助加熱溫度:550 ℃;噴霧電壓:-4500 V;去簇電壓:-80 V;碰撞能:一級-5 V,二級-35 eV;擴展碰撞能量:15 eV。

核磁鑒定:采用Bruker AV-600核磁共振儀,1H-NMR和13C-NMR的觀察頻率頻率為600 MHz,溶劑為CDCl3。

2 結果與討論

2.1化合物BLM-1:環木菠蘿烯酮(cycloartenone)的結構

白色固體粉末(氯仿),分子式C30H48O,分子量為424.70。通過Liebermann-Burchard反應結果為陽性,為甾類或三萜類化合物。在1H-NMR(CDCl3,600 MHz)譜中,δ5.10(1H,t,J=6.3 Hz,H-24)為1個雙鍵碳上質子信號,δ:1.70(3H,s,27-CH3)、1.82(3H,s,26-CH3)、1.25(3H,s,28-CH3)、1.11(3H,s,18-CH3)、0.92(3H,s,21-CH3)、1.05(3H,d,J=5.7 Hz,30-CH3)、1.25(3H,s,29-CH3)為7個甲基質子信號;0.59(1H,d,J=4.2 Hz,H-19a)、0.08(1H,d,J=4.2 Hz,H-19b)為1對環阿屯烷類型三萜的特征亞甲基質子信號。

13C-NMR(151 MHz,CDCl3)譜共給出30個碳信號:35.58(C-1)、37.48(C-2)、216.63(C-3)、50.24(C-4)、48.44(C-5)、22.18(C-6)、25.97(C-7)、47.89(C-8)、20.77(C-9)、25.87(C-10)、26.74(C-11)、33.42(C-12)、45.33(C-13)、48.73(C-14)、35.87(C-15)、28.14(C-16)、52.29(C-17)、17.64(C-18)、32.79(C-19)、29.56(C-20)、19.29(C-21)、36.32(C-22)、27.73(C-23)、124.21(C-24)、130.94(C-25)、24.93(C-26)、18.22(C-27)、29.56(C-28)、28.14.(C-29)、18.08(C-30)以上數據對比文獻[8-11]中環阿爾廷醇波譜學數據,除了3-C位變成了羰基,少了一個連氧碳上質子信號,其他部分都一致,故鑒定化合物BLM-1為環木菠蘿烯酮(cycloartenone),有報道菠蘿蜜樹的葉子和莖中存在該化合物[12],但本研究是首次從菠蘿蜜果皮中純化得到。

表1 化合物BLM-1的1H-NMR和13C-NMR數據Table 1 1H-NMR and 13C-NMR of compound BLM-1

綜上所述分析,結合1H-NMR和13C-NMR譜中數據見表1,鑒定化合物BLM-1為環木菠蘿烯酮(cycloartenone),化學結構式見圖1。

圖2 化合物BLM-1的結構式Fig.2 Thestuctures of compound BLM-1

2.2化合物BLM-2:環桉樹醇(cycloeucalenol)的結構

白色細小針狀晶(氯仿),分子式C30H50O,分子量426.72。通過Liebermann-Burchard反應結果為陽性,示為甾類或三萜類化合物。在1H-NMR(CDCl3,600 MHz)譜中,δ4.73(1H,t,J=6.3 Hz,H-24)為1個雙鍵碳上質子信號,δ0.17、δ0.38處是環丙基的兩個質子信號,δ1.08-1.39處是亞甲基的質子信號,δ0.91-1.60處是甲基的質子信號,δ3.20-3.28處是羥基附近的次甲基的質子信號。

13C-NMR(151 MHz,CDCl3)譜共給出30個碳信號:31.32(C-1)、37.81(C-2)、76.80(C-3)、43.33(C-4)、44.59(C-5)、24.67(C-6)、27.25(C-7)、46.88(C-8)、21.87(C-9)、29.71(C-10)、26.97(C-11)、35.34(C-12)、45.35(C-13)、48.90(C-14)、32.88(C-15)、25.17(C-16)、52.21(C-17)、17.79(C-18)、29.52(C-19)、19.13(C-20)、36.13(C-21)、35.01(C-22)、30.80(C-23)、156.92(C-24)、34.81(C-25)、23.55(C-26)、22.00(C-27)、105.93(C-28)、18.34.(C-29)、14.40(C-30)以上數據對比文獻[13-17]中環阿屯醇波譜學數據,除了24-C和25-C位變成了雙鍵,其他部分都一致,故鑒定化合物BLM-2為環桉樹醇(cycloeucalenol),有報道菠蘿蜜樹的葉子和莖中存在該化合物,但本研究是首次從菠蘿蜜果皮中純化得到。

表2 化合物BLM-2的1H-NMR和13C-NMR數據Table 2 1H-NMR and 13C-NMR of compound BLM-2

綜上所述分析,結合1H-NMR和13C-NMR譜中數據見表2,鑒定化合物BLM-2為環桉樹醇(cycloeucalenol),化學結構式見圖2。

圖3 化合物BLM-2的結構式Fig.3 The stuctures of compound BLM-2

3 結論

本研究采用柱層析分離方法對菠蘿蜜果皮乙醇提取物進行分離純化,利用硅膠柱、薄層層析和凝膠柱等分離手段,從乙酸乙酯部純化鑒定出BLM-1和BLM-2兩種化合物,經過質譜、1H-NMR和13C-NMR核磁共振波譜儀檢測后結構已確定,分別為環木菠蘿烯酮(cycloartenone)和環桉樹醇(cycloeucalenol),均為三萜類的化合物,由于時間關系未能對化合物進行進一步的活性鑒定,據多處文獻報道,此類化合物都共同具有溶血、抗癌、抗炎、殺菌、殺軟體動物、抗生育、增強免疫力等活性[18]。如,Titov等[5]對一些四環和五環三萜對七種人癌細胞的抗癌活性的構效進行了研究,發現3β,16α-二羥基-齊墩果-12烯在體外對HE6-1-A等6種癌細胞有抑制活性。用菌種Saccharomycescarlsbergensiss在體外進行實驗,研究了49種五環三萜類化合物的抗真菌活性,結果表明C-27或28位有游離羧基的齊墩果酸和常春藤皂苷元的皂苷具有較強的抗真菌活性[19-20]。以上兩種化合物均有報道存在于菠蘿蜜樹的葉子和莖中,但果皮中尚未有報道。本研究對菠蘿蜜的進一步研究有理論意義。

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Separation,purificationandstructuralanalysisofactivecompoundfromjackfruitpeel

PENGShao-dan,LIJi-hua,HUANGXiao-bing,LINLi-jing*

(Agricultural Products Processing Research Institute,Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences,Zhanjiang 524001,China)

To further explore the active ingredients of jackfruit peel,cycloartenone and cycloeucalenol were isolated from the fraction of ethyl acetate by using modern isolation techniques such as silica gel,thin-Layer chromatography and sephadex LH-20,and had been elucidated from1H-NMR and13C-NMR spectral data. This research will be useful for the further study of effective material basic of jackfruit,especially the characteristic composition of terpenoids.

jackfruit peel;active ingredients;monomer;structural identification

2017-02-20

彭芍丹(1989-)，女，碩士研究生，研究方向：天然產物化學，E-mail：282387502@qq.com。

*通訊作者:林麗靜(1978-)，男，博士，研究方向：天然產物化學，E-mail:49031788@qq.com。

公益性行業(農業)科研專項(201303077-4)；中國熱帶農業科學院基本科研業務費專項資金(1630122017T21)。

TS255.1

:A

:1002-0306(2017)17-0005-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.17.002