清熱養心顆粒對大鼠灌服環孢素藥動學影響△

吳磊，戴國梁，王瓊，陸超

(南京中醫藥大學 附屬醫院，江蘇 南京 210029)

·基礎研究·

清熱養心顆粒對大鼠灌服環孢素藥動學影響△

吳磊，戴國梁，王瓊，陸超*

(南京中醫藥大學 附屬醫院，江蘇 南京 210029)

目的：研究清熱養心顆粒(QG)對環孢素(cyclosporine A，CsA)的藥代動力學的影響。方法：超高效液相串聯質譜測定大鼠全血中CsA濃度，實驗動物分為對照組和實驗組，對照組單獨灌胃給予CsA，實驗組灌胃給予清熱養心顆粒及CsA。DAS 3.0藥動學軟件計算藥動學參數。結果：CsA單獨給藥、CsA-清熱養心顆粒聯合給藥，CsA在體內代謝動力學模型均為一室開放模型，聯合給藥后，CsA的t1/2顯著延長，AUC顯著增大。結論：清熱養心顆粒可減慢CsA在體內的代謝過程。

清熱養心顆粒；環孢素；大鼠；藥代動力學；超高效液相串聯質譜

環孢素(cyclosporine A，CsA)是一種臨床常用的免疫抑制劑，適用于預防同種異體腎、肝、心、骨髓等器官或組織移植所發生的排斥反應。CsA的最小有效劑量到中毒劑量之間的劑量差值越窄，藥物安全性越差。藥物濃度過高會引起腎毒性、高血壓等不良反應，但是不完全和不規則的口服吸收又會引起毒性的增加或免疫治療失敗[1-2]。大多數藥物和食物會通過調控P-gp或CYP3A等方面來影響CsA的治療全過程，一些鈣離子通道拮抗劑抑制P-gp和CYP3A從而使病人口服CsA后體內血藥濃度的血藥濃度-時間曲線下面積和峰濃度有了顯著的提高[3-5]。

清熱養心顆粒(QG)的處方是由金銀花、甘草、山豆根等多味藥組成，是江蘇省中醫院專家總結了傳統中醫學家治療病毒性心肌炎的經驗方藥后，臨床多年嘗試研制而成，具有清熱解毒、養心安神功能。金銀花自古被中醫譽為清熱解毒的良藥，其酚酸類成分具有顯著的抗炎、抗氧化、抗凝血等作用[6-7]。甘草性溫，其活性成分甘草次酸有著一定的抗炎、抗病毒的功效[8]。百合主治勞嗽、咳血、虛煩驚悸等癥，活性成分薯蕷皂苷元有效提高氧自由基清除能力，對血管內皮細胞功能進行改善[9]。苦參味苦，性寒，具有清熱燥濕、祛風解毒的作用，其活性成分氧化苦參堿臨床使用廣泛，對心肌缺血和梗死有保護作用[10-11]。臨床上，病毒性心肌炎患者在服用清熱養心顆粒時常會與環孢素同用，發現療效顯著。

本實驗對大鼠進行研究，臨床使用中等效治療量作為參照，對單劑量給予清熱養心顆粒后大鼠體內CsA藥動學參數的變化情況進行考察，以及清熱養心顆粒在口服CsA的體內藥動學過程是否產生影響進行研究，進一步判斷清熱養心顆粒是否為影響CsA的血藥濃度的主要因素，為臨床使用研究提供更多的理論依據。

1 材料

1.1 試藥

清熱養心顆粒(江蘇省中醫院制劑，10 g/袋，批號：20160501)；環孢素軟膠囊(華北制藥股份有限公司，25 mg/粒，批號：160110)；對照品CsA(浙江瑞邦藥業有限公司，批號：10-140317，含量：99.3%)；環孢素D(上海同田生物技術股份有限公司，含量為95%，批號：13060821)。水為超純水，甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

Agilent G6430UHPLC-MS/MS液質聯用儀(美國Agilent公司，所配超高效液相儀為Agilent 1290)；MassHunter數據處理系統(version B.05.00)；WH-2微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠)；AE240電子天平(上海梅特勒-托利多有限公司)；Millipore Drict-Q5純水機(法國Millipore公司)；Labconco離心濃縮儀(美國Labconco公司)；Biofuge PrimoR冷凍高速離心機(德國Heraeus公司)。

1.3 動物

SD大鼠16只，雌雄各半，體重約250～270 g，由南通大學比較醫學中心提供，合格證號：SCXK(蘇)2014-0001。

2 方法

2.1 色譜及質譜檢測條件

Phenomenex Gemini C18色譜柱(100 mm×2.0 mm，3 μm)；流動相：甲醇-2 mmol·L-1甲酸銨水溶液(75∶25)；流速：400 μL·min-1；柱溫：60 ℃。離子源：ESI；離子化模式：正離子；定量模式：多反應監測模式(MRM)；毛細管電壓：4000 V；干燥氣溫度：400 ℃；CsA的Fragmentor及CE值分別為100、15 V；內標環孢素D的Fragmentor及CE值分別為110、10 V；檢測對象：CsAm/z220.2→m/z202.9；環孢素Dm/z234.3→m/z216.9。

2.2 對照品溶液的配制

取對照品CsA適量，精密稱定，甲醇作為溶劑，將其稀釋成0.05、0.25、0.5、2.5、5、10、50 μg·mL-1的系列對照品溶液。放冰箱保存(4 ℃)，備用。

2.3 內標物溶液的配制

取對照品環孢素D適量，精密稱定，甲醇作為溶劑，將其稀釋成1.1 μg·mL-1的內標物溶液，放冰箱保存(4 ℃)，備用。

2.4 全血樣品處理

取全血100 μL，精密吸取，加入氟化鈉10 mg，內標溶液10 μL(1.1 μg·mL-1)，渦旋30 s，加入乙醚1 mL，渦旋3 min，混合，4 000 r·min-1離心10 min后吸取上清液乙醚層，40 ℃氮氣吹干，加入100 μL 75%的甲醇水溶液進行復溶，渦旋振蕩2 min后，冷凍高速離心機(12 000 r·min-1)離心10 min，吸取上清液，5 μL分析進樣。

2.5 藥代動力學研究

大鼠16只(雌雄各半)，每組隨機分得8只，并標記為實驗組與對照組，在大鼠給藥之前12 h禁食不禁水。實驗組同時灌胃給予QG(100 mg·kg-1)、與CsA(10 mg·kg-1)；對照組只灌胃給予CsA(10 mg·kg-1)。2組大鼠分別于給藥前及給藥后0.083、0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8、12、24、32、48 h從眼底靜脈叢采血約0.2 mL。將全血樣品于4 ℃保存。

2.6 數據處理

根據測得的血藥濃度-時間，采用DAS 3.0處理與擬合，獲得藥動學參數。采用SPSS 15.0軟件對實驗組和對照組的藥動學參數進行配對t檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 專屬性實驗

在色譜檢測下，CsA和環孢素D的保留時間約為1.85 min和1.71 min(見圖1、2)。CsA和內標物環孢素D互不干擾，峰形較好，無雜峰干擾，基線平穩。

3.2 標準曲線制備

取空白全血100 μL，加入CsA系列標準溶液各10 μL，配制成相當于CsA全血質量濃度分別為0.005、0.025、0.05、0.25、0.5、1、5 μg·mL-1的全血樣品。取5 μL分析，以峰面積與內標峰面積的比值Y對全血質量濃度X進行線性回歸運算，求得CsA的回歸方程：Y=0.456 2X-0.346 1(r=0.994 9)，定量下限是5 ng·mL-1。

注：A.空白全血樣品；B.空白全血加入CsA (0.5 μg·mL-1)及環孢素D(1.1 μg·mL-1)；C.大鼠同時口服QG及CsA 6 h后全血樣品；下同。圖1 CsA的UHPLC-MS/MS離子流圖

注：A.空白全血樣品；B.空白全血加入CsA (0.5 μg·mL-1)及環孢素D(1.1 μg·mL-1)；C.大鼠同時口服QG及CsA 6 h后全血樣品。圖2 環孢素D(內標)的UHPLC-MS/MS離子流圖

3.3 準確度和精密度

精密吸取空白全血100 μL，制備CsA 3個不同濃度(CsA全血質量濃度為0.01、0.5、4 μg·mL-1)的質控樣品，每個濃度平行5份，連續3 d。根據隨性標準曲線求得實測濃度。通過實測濃度計算出精密度和準確度。結果顯示：CsA日內、日間準確度分別為96.2%～105.6%(RSD≤7.1%，n=5)和94.2%～107.3%(RSD≤7.9%，n=15)，結果經鑒定符合分析要求。

3.4 提取回收率

取空白全血100 μL，配制3.3項下低、中、高3個不同質量濃度含藥全血質控樣品，按2.4項下方法處理后分析，以全血中CsA的峰面積與相應質量濃度對照品溶液中CsA峰面積的比值計算出上述3種質量濃度的提取回收率，每個濃度平行做5份。經UHPLC-MS/MS測定后，由低到高3個質量濃度下CsA的提取回收率分別為：(71.4%±2.4%)、(72.3%±3.1%)和(71.7%±2.7%)。同時得到內標的提取回收率為(69.6%±2.8%)。

3.5 穩定性考察

取空白全血100 μL，配制3.3項下3個質量濃度含藥全血質控樣品，按上述樣品的處理方法處理。分析物置溶液中24 h(室溫)、將含藥的全血樣品置冰箱(-20 ℃)凍融3次、置冰箱(-40 ℃)長期冷凍28 d，對穩定性進行穩定性考察，樣品平行3份。結果顯示，24 h后(室溫)環孢素質量濃度的RSD均小于8.3%，冰箱(-40 ℃)保存28 d質量濃度的RSD 均小于9.6%，環孢素經3個凍融期的質量濃度RSD均小于7.8%。

3.6 基質效應考察

取1.5 mL EP管若干，分別精密吸取質量濃度為0.1、5、40 μg·mL-1的CsA對照品溶液各10 μL，同時加入10 μL環孢素D溶液(內標)，再加入純水補足至100 μL，渦旋震蕩30 s，取5 μL溶液進UHPLC-MS/MS，測定分析物及內標峰面積并定義為A1。除不加環孢素D溶液(內標)外，另按2.4項下方法制備空白全血樣品若干，氮氣吹干后同上處理，測定分析物及內標峰面積并定義為A2。基質效應ME(%)等于兩者之間的比值(A2/A1×100%)。3個不同濃度的CsA在全血樣品中的基質效應分別為88.6%、92.3%、91.7%(n=3)，環孢素D(內標)基質效應為93.2%(n=9)。

3.7 大鼠體內藥代動力學

表 1 對照組和實驗組中大鼠體內環孢素的主要藥動學參數

注：* P < 0.05。圖3 對照組和實驗組中大鼠體內環孢素 的平均血藥濃度-時間曲線

4 討論

目前，一般采用熒光偏振免疫分析法檢測全血中CsA的濃度，但成本較高。本實驗改用UHPLC-MS/MS法測定全血樣品濃度，經過方法學確證后，符合生物樣品分析方法的要求，并且該方法靈敏度高、分析時間短，可用于臨床上大批樣品的連續測定。

相關中藥與CsA藥物相互作用的研究已有報道，研究表明，人體同時服用鹽酸小檗堿與CsA時，可促進CsA的吸收，從而提高CsA的生物利用度[12-13]。清熱養心顆粒中黃連是全方的君藥，而鹽酸小檗堿是黃連主要活性成分，由此推測清熱養心顆粒中的鹽酸小檗堿促進了CsA的體內吸收，但確切的作用機制則有待進一步研究。

由于CsA治療窗窄，毒性較大，體內CsA濃度的升高可能會引起嚴重不良反應。因此，臨床上同時使用清熱養心顆粒與CsA時，應密切監測CsA在血液中的濃度及人體相關生化指標，避免不良反應的發生。

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EffectofQingreyangxinGranuleonPharmacokineticsofIntragastricallyAdministeredCyclosporineAinRats

WULei，DAIGuoliang，WANGQiong，LUChao*

(AffiliatedHospitalofNanjingUniversityofTraditionalChineseMedicine，Nanjing210029，China)

Objective：To investigate the pharmacokinetic effect of Qingreyangxin granule (QG) on cyclosporine A (CsA) in rats.Methods：Concentration of cyclosporine A in rat whole blood was detected by UHPLC-MS/MS after rats were oral administration of QG or QG combined with CsA.Pharmacokinetic parameters were calculated by DAS 3.0 pharmacokinetic software.Results：Invivopharmacokinetic models of CsA.were one-compartment open models in both of the QG group and the QG combined with CsA group.After compatibility，CsA showed a significant longer int1/2，with significant increase in AUC.Conclusion：QG can reduce metabolic process of CsAinvivo.

Qingreyangxin granule；cyclosporine A；rat；pharmacokinetics；UHPLC-MS/MS

江蘇省中醫藥管理局項目(JD201512)；江蘇省藥學會-奧賽康醫院藥學基金(A201607)

] 陸超，碩士，主管中藥師，研究方向：中藥臨床藥代動力學；E-mail：sinkly228@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.6.012

2016-10-18)

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