地榆鞣質(zhì)在大鼠尿液中代謝產(chǎn)物分析

周本宏，汪靜，吳玥，易慧蘭，譚珺，張紅盼

(1.武漢大學(xué) 人民醫(yī)院 藥學(xué)部，湖北 武漢 430060；2.武漢大學(xué) 藥學(xué)院，湖北 武漢 430072)

·基礎(chǔ)研究·

地榆鞣質(zhì)在大鼠尿液中代謝產(chǎn)物分析

周本宏1，2*，汪靜1，吳玥1，易慧蘭1，譚珺2，張紅盼1

(1.武漢大學(xué) 人民醫(yī)院 藥學(xué)部，湖北 武漢 430060；2.武漢大學(xué) 藥學(xué)院，湖北 武漢 430072)

目的：采用HPLC-Q-TOF/MS研究地榆鞣質(zhì)在尿液中的代謝產(chǎn)物。方法：收集給藥后大鼠尿樣，采用ZORBAX Eclipse XDB-C18(150 mm×2.1 mm，5 μm)色譜柱，以乙腈-水為流動相梯度洗脫，在飛行時間質(zhì)譜負(fù)離子模式下掃描，利用TOF/MS得到的準(zhǔn)確相對分子質(zhì)量及一級、二級質(zhì)譜信息，對照化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫，鑒定地榆鞣質(zhì)在大鼠尿液中可能的代謝產(chǎn)物，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，推測地榆鞣質(zhì)在大鼠體內(nèi)可能的代謝途徑。結(jié)果：從大鼠尿液中共檢測到9個代謝產(chǎn)物，分別為：M1(Pyrogallol)、M2(Urolithin B)、M3(Methyl-Urolithin C)、M4(Urolithin A)、M5(Methyl-Urolithin A)、M6(Urolithin C-Glucuronidation)、M7(Dimethy-EA)、M8(Urolithin M5)、M9(沒食子酸)，其中M9為原型藥物。結(jié)論：地榆鞣質(zhì)經(jīng)灌胃給予大鼠后，先經(jīng)過I相代謝反應(yīng)生成尿石素等極性偏小的代謝產(chǎn)物吸收進(jìn)入體內(nèi)，再發(fā)生II相結(jié)合反應(yīng)，與葡萄糖醛酸等結(jié)合，變成極性較大的物質(zhì)，從尿液排除體外，進(jìn)一步闡明了地榆鞣質(zhì)在體內(nèi)發(fā)揮藥理作用的機(jī)理。

地榆；鞣質(zhì)；代謝產(chǎn)物；尿石素；液質(zhì)聯(lián)用

地榆是我國傳統(tǒng)的中藥，是薔薇科植物地榆SanguisorbaofficinalisL.或長葉地榆SanguisorbaofficinalisL.var.longifolia的干燥根莖，性微寒，具有涼血止血、解毒斂瘡的功效，臨床上用于便血、痣血、水火燙傷等的治療[1]。隨著人們對地榆深入研究，發(fā)現(xiàn)地榆中主要含有鞣質(zhì)(約17%)、三萜皂苷(約2.0%～4.1%)和黃酮(約15%)三大類化學(xué)成分，其中鞣質(zhì)類成分主要為沒食子酸、鞣花鞣質(zhì)等可水解鞣質(zhì)和原花青素類縮合鞣質(zhì)[2]，是一類生物活性較強(qiáng)的物質(zhì)，對其藥理作用的發(fā)揮起著重要作用。研究證實(shí)地榆鞣質(zhì)具有抗肝癌細(xì)胞增殖[3]、抑制腎小管上皮細(xì)胞增殖[4]、改善環(huán)磷酸酰胺誘導(dǎo)的小鼠骨髓抑制[5]等作用。藥物的活性與其在體內(nèi)的代謝轉(zhuǎn)運(yùn)密切相關(guān)，目前尚未見地榆鞣質(zhì)代謝成分的報道，本研究采用HPLC-ESI-Q-TOF-MS對地榆鞣質(zhì)在尿液中代謝產(chǎn)物進(jìn)行初步鑒別，進(jìn)而探討可能的代謝過程，有助于闡明其發(fā)揮藥理活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，為地榆鞣質(zhì)的進(jìn)一步研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

HPLC1200-Q-TOF 6520MS(Agilent，USA)，配有電噴霧離子源(ESI)；UV-1800紫外分光光度計(SHIMADZU CORPORATION)；HPD-400大孔吸附樹脂(滄州寶恩化工有限公司)；Generik C18固相萃取小柱(Sepax，200 mg/3mL)；SK5200H型超聲波清洗儀(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)；W2-100S型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司)；DZF-6050型真空干燥箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；ALPHAI-4/RZ-2冷凍干燥機(jī)(德國Martin Christ)。

1.2 藥材

生地榆飲片(湖北盛德堂中藥飲片股份有限公司)，經(jīng)武漢大學(xué)張洪教授鑒定符合《中華人民共和國藥典》2015年版一部標(biāo)準(zhǔn)；沒食子酸(成都行標(biāo)生物科技有限公司，純度≥98%)；甲醇、乙腈(Agilent，HPLC級)，水(娃哈哈純凈水)，磷鉬鎢酸(自制)，乙醇、丙酮等試劑均為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物

雌性SD大鼠10只，體重為220～260 g，由湖北省實(shí)驗(yàn)動物中心提供，實(shí)驗(yàn)動物許可證號：SCXK(鄂)2008-0005。動物飼養(yǎng)于武漢大學(xué)動物中心SPF級動物房中，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后開始實(shí)驗(yàn)。

2 方法

2.1 地榆鞣質(zhì)樣品的制備

干燥生地榆飲片，粉碎機(jī)粉碎，稱取適量，加入10倍量的70%丙酮，室溫浸泡過夜，50 ℃下回流提取2次，每次30 min，合并濾液，減壓濃縮除去丙酮，濃縮液冷凍干燥，制備得到地榆粗提取物。經(jīng)HPD-400大孔吸附樹脂純化，70%乙醇洗脫，洗脫液冷凍干燥，得地榆鞣質(zhì)提取物(STE)，凍干粉4 ℃冰箱保存，備用[6]。

2.2 動物分組與給藥

雌性SD大鼠10只，隨機(jī)分為給藥組和空白組，每組5只，飼養(yǎng)于SPF級動物房中，實(shí)驗(yàn)開始前適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，自由進(jìn)食飲水。大鼠給藥前禁食12 h，給藥后置于代謝籠中，自由飲水，收集各組尿液。給藥組按400 mg·kg-1劑量灌胃地榆鞣質(zhì)，空白組給予等量0.9%氯化鈉溶液，收集大鼠給藥后0～8、8～24、24～48 h的尿液，-20 ℃冷凍保存，備用待測[7-9]。

2.3 尿液樣品預(yù)處理

低溫解凍尿液，取尿液2 mL，加10 μL 6 mol·L-1HCl酸化，離心，取上清液，過反相C18固相萃小柱(經(jīng)5 mL甲醇，5 mL水活化)，純水(5 mL)淋洗后，用甲醇(2 mL)洗脫，收集洗脫液，過0.45 μm微孔濾膜，濾液直接進(jìn)HPLC-ESI-Q TOF MS分析[10]。

2.4 色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18(150mm×2.1 mm，5 μm)；流動相A(水)和B(乙腈)，按程序梯度洗脫(0～15 min，5%～15% B；15～25 min，15%～40% B；25～40 min，40%～45%B；40～55 min，45%～50% B；55～60 min，50%～55% B；60～65 min，55%～60% B；65～75 min，60%～90% B；75～85 min，90%～30% B；85～90 min，30%～5% B)；流速：0.2 mL·min-1；進(jìn)樣體積：10 μL；柱溫：30 ℃。

2.5 質(zhì)譜條件

采用電噴霧(ESI)離子源，負(fù)離子模式檢測；毛細(xì)管電壓：3500 V；霧化氣壓力：30 Psi(1 Psi=6.895 kPa)；干燥氣流速：10 L·min-1；干燥氣溫度：300 ℃；碎片電壓：125 V。采用全掃描一級質(zhì)譜、選擇離子二級全掃描質(zhì)譜方式同時進(jìn)行，掃描范圍m/z：100～800。

2.6 尿液中代謝產(chǎn)物的鑒別

根據(jù)藥物在體內(nèi)代謝的一般規(guī)律，即Ⅰ相反應(yīng)和Ⅱ相結(jié)合反應(yīng)，查閱相關(guān)文獻(xiàn)，預(yù)測地榆鞣質(zhì)在大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物。運(yùn)用質(zhì)譜軟件上自帶的相對分子量計算功能，即輸入分子式計算出相應(yīng)相對分子質(zhì)量，算出預(yù)測代謝產(chǎn)物的[M-H]-、[M+Cl]-、[M+Br]-的精確分子質(zhì)量(精確到小數(shù)點(diǎn)后5位)。大鼠尿樣過0.45 μm微孔濾膜后，進(jìn)行HPLC-ESI-Q-TOF-MS分析，得到大鼠空白尿樣和灌胃給藥后尿樣總離子流色譜圖，通過系統(tǒng)自帶的提取離子流色譜(EIC)功能提取出預(yù)測代謝產(chǎn)物的[M-H]-、[M+Cl]-、[M+Br]-峰，比較空白和給藥后尿液EIC圖譜，確定給藥后多出來的峰或給藥后峰強(qiáng)度變強(qiáng)的峰為差異峰，由差異峰與預(yù)測代謝產(chǎn)物間對比(質(zhì)量偏差在±5×10-6范圍內(nèi))，初步鑒定尿液中代謝產(chǎn)物。可能的話，進(jìn)一步對差異峰中離子打碎，做二級質(zhì)譜，結(jié)合二級譜圖分析驗(yàn)證代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)[11-12]。

3 結(jié)果

3.1 LC-MS條件的選擇與優(yōu)化

考察了甲醇-水、乙腈-水系統(tǒng)對譜圖的影響，發(fā)現(xiàn)以乙腈為有機(jī)相洗脫時，各色譜峰分離效果較好，基線較平穩(wěn)，故選用乙腈-水作為梯度洗脫的流動相。比較了正負(fù)離子模式下的總離子流色譜圖，發(fā)現(xiàn)負(fù)離子模式下峰容量大，質(zhì)譜響應(yīng)更好，故實(shí)驗(yàn)

選擇負(fù)離子模式下進(jìn)行檢測。

3.2 地榆鞣質(zhì)尿液中代謝產(chǎn)物初步鑒定

大鼠空白尿樣和灌胃給藥后尿樣總離子流色譜圖見圖1。通過提供的精確分子質(zhì)量和二級碎片信息，在大鼠尿樣中共檢測到9個代謝產(chǎn)物，結(jié)果見表1。

注：A.空白尿樣；B.給藥組尿樣。圖1 大鼠空白尿樣和灌胃給藥后尿樣總離子流色譜圖

編號tR/min鑒定結(jié)果分子式m/z([M?H]-)m/z([M+Cl]-)實(shí)測值理論值偏差實(shí)測值理論值偏差M11604PyrogallolC6H6O31250242712502442-121610011M25890Uro?BC13H8O3211040972110400742624701675M331942Methyl?Uro?CC14H10O5257045922570455514429302222M432423Uro?AC13H8O4227035832270349837426301166M539534Methyl?Uro?AC14H10O4241051482410506335327702731M631926Uro?C?GluC19H16O11419061984550381545503866-112M738876Dimethy?EAC16H10O83290290832903029-36836500697M862793Uro?M5C13H8O72750190927501973-2333109964M984302GallicacidC7H6O51690140616901425-11220499092

注：Uro—Urolithin；Glu—Glucuronidation；EA—Ellagic acid。

代謝產(chǎn)物M1：保留時間tR=1.604 min，ESI/MS分子離子峰[M-H]-m/z為125.024 27，與預(yù)測代謝產(chǎn)物相應(yīng)的精確分子質(zhì)量125.024 42對比，初步推測其為Pyrogallol，同時MS2譜圖中顯示碎片離子m/z81.034 3，其分子量與M1相比減少了44 Da，可推測M1分子離子失去了一個CO2，產(chǎn)生碎片離子[M-COO-H]-，與文獻(xiàn)報道的Pyrogallol二級質(zhì)譜碎片一致[13]，進(jìn)一步證實(shí)該代謝產(chǎn)物為焦性沒食子酸(Pyrogallol)(見圖2、3)。可能的裂解途徑見圖4。

圖2 代謝產(chǎn)物M1結(jié)構(gòu)式

注：A.空白尿樣在m/z 125.024 42的提取離子流色譜圖(EIC)；B.給藥組尿樣在m/z 125.024 42的提取離子流色譜圖(EIC)；C.保留時間tR=1.604 min時，給藥組尿樣EIC圖的一級(MS)質(zhì)譜圖；D.碎片離子m/z 125的二級(MS/MS)質(zhì)譜圖。圖3 代謝產(chǎn)物M1的質(zhì)譜圖

圖4 代謝產(chǎn)物M1的裂解途徑

代謝產(chǎn)物M2：保留時間tR=5.890 min，ESI/MS分子離子峰[M-H]-m/z為211.040 97，與預(yù)測代謝產(chǎn)物相應(yīng)的精確分子質(zhì)量211.040 07對比，初步推測其為Uro B，同時MS2譜圖中顯示碎片離子m/z166.980 58，其分子量與M2相比減少44 Da，推測M2分子離子失去了一個CO2，產(chǎn)生碎片離子[M-COO-H]-，與文獻(xiàn)[14]報道的代謝產(chǎn)物Uro B二級質(zhì)譜碎片一致，進(jìn)一步證實(shí)該代謝產(chǎn)物為尿石素B(Urolithin B)(見圖5、6)。可能的裂解途徑見圖7。

圖5 代謝產(chǎn)物M2結(jié)構(gòu)式

注：A.空白尿樣在m/z 211.040 07的提取離子流色譜圖(EIC)；B.給藥組尿樣在m/z 211.040 07的提取離子流色譜圖(EIC)；C.保留時間tR=5.890 min時，給藥組尿樣EIC圖的一級(MS)質(zhì)譜圖；D.碎片離子m/z 211的二級(MS/MS)質(zhì)譜圖。圖6 代謝產(chǎn)物M2質(zhì)譜圖

圖7 代謝產(chǎn)物M2裂解途徑

代謝產(chǎn)物M3：保留時間tR=31.942 min，ESI/MS分子離子峰[M-H]-m/z為257.045 92，與預(yù)測代謝產(chǎn)物相應(yīng)的精確分子質(zhì)量257.045 55對比，初步推測其為Methyl-Uro C，同時MS2譜圖中顯示碎片離子m/z242.016 81，與M3相比其分子量減少15 Da，推測分子離子失去一個甲基生成碎片離子[M-CH3-H]-，與文獻(xiàn)[15]報道的代謝產(chǎn)物Methyl-Uro C二級質(zhì)譜碎片一致，進(jìn)一步證實(shí)該代謝產(chǎn)物為甲基化尿石素C(Methyl-Urolithin C)(見圖8、9)。可能的裂解途徑見圖10。

圖8 代謝產(chǎn)物M3結(jié)構(gòu)式

注：A.空白尿樣在m/z 257.045 55的提取離子流色譜圖(EIC)；B.給藥組尿樣在m/z 257.045 55的提取離子流色譜圖(EIC)；C.保留時間tR=31.942 min時，給藥組尿樣EIC圖的一級(MS)質(zhì)譜圖；D.碎片離子m/z 257的二級(MS/MS)質(zhì)譜圖。圖9 代謝產(chǎn)物M3質(zhì)譜圖

圖10 代謝產(chǎn)物M3裂解途徑

代謝產(chǎn)物M4：保留時間tR=32.423min，ESI/MS分子離子峰[M-H]-m/z為227.035 83，與預(yù)測代謝產(chǎn)物相應(yīng)的精確分子質(zhì)量227.034 98對比，初步推測其為Uro-A或Iso-Uro-A，同時MS2譜圖中顯示存在碎片離子m/z199.039 47[M-CO-H]-，與文獻(xiàn)報道的代謝產(chǎn)物Uro-A二級質(zhì)譜碎片一致[14]，進(jìn)一步證實(shí)該代謝產(chǎn)物為尿石素A(Urolithin A)(見圖11、12)。可能的裂解途徑見圖13。

圖11 代謝產(chǎn)物M4結(jié)構(gòu)式

注：A.空白尿樣在m/z 277.034 98的提取離子流色譜圖(EIC)；C.給藥組尿樣在m/z 227.034 98的提取離子流色譜圖(EIC)；C.保留時間tR=32.455 min時，給藥組尿樣EIC圖的一級(MS)質(zhì)譜圖；D.碎片離子m/z 227的二級(MS/MS)質(zhì)譜圖。圖12 代謝產(chǎn)物M4質(zhì)譜圖

圖13 代謝產(chǎn)物M4裂解途徑

代謝產(chǎn)物M5：保留時間tR=39.534 min，ESI/MS分子離子峰[M-H]-m/z為241.051 48，與預(yù)測代謝產(chǎn)物相應(yīng)的精確分子質(zhì)量241.050 63對比，初步推測其為Methyl-Uro-A，同時MS2譜圖中顯示碎片離子m/z210.903 96[M-OCH2-H]-，m/z196.986 02[M-COO-H]-與文獻(xiàn)報道的代謝產(chǎn)物Methyl-Uro-A二級質(zhì)譜一致[14]，進(jìn)一步證實(shí)該代謝產(chǎn)物為甲基化尿石素A(Methyl-Uro-A)(見圖14、15)。可能的裂解途徑見圖16。

圖14 代謝產(chǎn)物M5結(jié)構(gòu)式

注：A.空白尿樣在m/z 241.050 63的提取離子流色譜圖(EIC)；B.給藥組尿樣在m/z 241.050 63的提取離子流色譜圖(EIC)； C.保留時間tR=39.534 min時，給藥組尿樣EIC圖的一級(MS)質(zhì)譜圖；D.碎片離子m/z241的二級(MS/MS)質(zhì)譜圖。圖15 代謝產(chǎn)物M5的質(zhì)譜圖

代謝產(chǎn)物M6、M7、M8、M9：因其二級質(zhì)譜不穩(wěn)定，故只通過分子離子峰與預(yù)測代謝產(chǎn)物精確相對分子質(zhì)量對比，進(jìn)行初步的判斷。其中M6保留時間tR=31.926 min，ESI/MS分子離子峰[M+Cl]-m/z為455.038 15，與預(yù)測代謝產(chǎn)物相應(yīng)的計算值455.038 66對比，初步推測其為Uro-C-Glur；代謝產(chǎn)物M7 保留時間tR=38.876 min，ESI/MS分子離子峰[M-H]-m/z為329.029 08，與預(yù)測代謝產(chǎn)物相應(yīng)的計算值329.030 29對比，初步推測其為Dimethy-EA；代謝產(chǎn)物M8 保留時間tR=62.793 min，ESI/MS分子離子峰[M-H]-m/z為275.019 09，與預(yù)測代謝產(chǎn)物相應(yīng)的計算值275.019 73對比，初步推測其為Uro-M5；代謝產(chǎn)物M9 保留時間tR=84.302 min，ESI/MS分子離子峰[M-H]-m/z為169.014 06，與預(yù)測代謝產(chǎn)物相應(yīng)的計算值169.014 25對比，初步推測其為Gallic acid(見圖17～21)。

圖16 代謝產(chǎn)物M5裂解途徑

注：A.空白尿樣在m/z 455.038 66的提取離子流色譜圖(EIC)；B.給藥組尿樣在m/z 455.038 66的提取離子流色譜圖(EIC)；C.保留時間tR=39.534 min時，給藥組尿樣EIC圖的一級(MS)質(zhì)譜圖。圖18 代謝產(chǎn)物M6的質(zhì)譜圖

圖17 代謝產(chǎn)物M6、M7、M8、M9結(jié)構(gòu)式

注：A.空白尿樣在m/z 329.030 29的提取離子流色譜圖(EIC)；B.給藥組尿樣在m/z 329.030 29的提取離子流色譜圖(EIC)；C.保留時間tR=39.534 min時，給藥組尿樣EIC圖的一級(MS)質(zhì)譜圖。圖19 代謝產(chǎn)物M7的質(zhì)譜圖

注：A.空白尿樣在m/z 275.019 73的提取離子流色譜圖(EIC)；B.給藥組尿樣在m/z 275.01973的提取離子流色譜圖(EIC)；C.保留時間tR=39.534 min時，給藥組尿樣EIC圖的一級(MS)質(zhì)譜圖。圖20 代謝產(chǎn)物M8的質(zhì)譜圖

注：A.空白尿樣在m/z 169.014 25的提取離子流色譜圖(EIC)；B.給藥組尿樣在m/z 169.014 25的提取離子流色譜圖(EIC)；C.保留時間tR=39.534 min時，給藥組尿樣EIC圖的一級(MS)質(zhì)譜圖。圖21 代謝產(chǎn)物M9的質(zhì)譜圖

4 討論

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-MS)是近些年發(fā)展起來的一種現(xiàn)代分析技術(shù)，它以高效液相色譜為分離手段，以質(zhì)譜為檢測器，既具有液相色譜高分離能力的特性，又具有質(zhì)譜高靈敏度、高專屬性的優(yōu)點(diǎn)[16]。在藥物代謝轉(zhuǎn)化研究中，生物樣品中的藥物和代謝產(chǎn)物分離純化、分析和鑒定工作非常重要，傳統(tǒng)的分離純化工作常需借用大孔樹脂、凝膠柱、制備型色譜柱等柱色譜技術(shù)來進(jìn)行，工作量大、耗時、且需要的樣品量大。而生物樣品中藥物及代謝產(chǎn)物往往濃度較低，加上內(nèi)源性雜質(zhì)的干擾，使得目標(biāo)物的分離、分析難度加大，從而對分析方法的靈敏度和特異性提出更高的要求。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)為藥物代謝研究提供了強(qiáng)有力的手段，目前HPLC-Q-TOF-MS越來越多地被用于中藥成分及代謝產(chǎn)物的快速檢測[17-18]。

生物樣品具有成分復(fù)雜、干擾物多且待測物含量低的特點(diǎn)，故而在對生物樣品進(jìn)行分析前，需要進(jìn)行一系列預(yù)處理。固相萃取(SPE)[19]是固液萃取和柱液色譜技術(shù)結(jié)合的一種預(yù)處理技術(shù)，主要用于樣品的分離、純化和濃縮，與傳統(tǒng)萃取相比可提高待測物的回收率，更有效分離雜質(zhì)，且操作簡單、省時省力。為了快速除去尿液樣品中的蛋白質(zhì)及雜質(zhì)等干擾物，本實(shí)驗(yàn)采用C18固相萃取小柱對尿液樣品中進(jìn)行了簡單的預(yù)處理。

實(shí)驗(yàn)過程中，通過比較不同有機(jī)相及調(diào)整有機(jī)相-水相比例后譜圖中出峰情況，確定液相色譜的流動相和洗脫條件，同時通過對比正負(fù)離子條件下譜圖中響應(yīng)值大小和出峰的數(shù)目，最終選擇負(fù)離子掃描模式，這可能與代謝產(chǎn)物中大多含有羥基等官能團(tuán)有關(guān)。

大鼠灌胃給予地榆鞣質(zhì)提取物后，經(jīng)HPLC-Q-TOF/MS分析，從其尿液中共檢測到9個代謝產(chǎn)物，分別為焦性沒食子酸(Pyrogallol)(M1)、尿石素B(Urolithin B)(M2)、甲基化尿石素C(Methyl-Urolithin C)(M3)、尿石素A(Urolithin A)(M4)、甲基化尿石素A(Methyl-Urolithin A)(M5)、葡萄糖醛酸化尿石素C(Urolithin C-Glucuronidation)(M6)、二甲基化鞣花酸(Dimethy-EA)(M7)、尿石素M5(Urolithin M5)(M8)、沒食子酸(Gallic acid)(M9)，其中M9為原型藥物。地榆鞣質(zhì)進(jìn)入大鼠體內(nèi)，一方面沒食子酸類鞣質(zhì)水解產(chǎn)生沒食子酸(Gallic acid)，沒食子酸在腸道菌群的作用下進(jìn)一步代謝成焦性沒食子酸(Pyrogallol)，另一方面鞣花鞣質(zhì)經(jīng)水解形成鞣花酸(EA)，鞣花酸在腸道菌群的作用下進(jìn)一步代謝成尿石素類化合物(urolithins)。推測地榆鞣質(zhì)首先經(jīng)I相代謝形成尿石素等極性偏小的代謝產(chǎn)物吸收進(jìn)入體內(nèi)，再發(fā)生II相結(jié)合反應(yīng)，與葡糖糖醛酸等結(jié)合增大極性，進(jìn)而從尿液排除體外[20]。地榆鞣質(zhì)在體內(nèi)可能的代謝途徑見圖22。

圖22 地榆鞣質(zhì)在體內(nèi)的代謝途徑

鞣質(zhì)是一類結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜的多元酚類化合物，按結(jié)構(gòu)式可分為水解鞣質(zhì)、縮合鞣質(zhì)和復(fù)合鞣質(zhì)[21]。鞣花鞣質(zhì)(Ellagitannins)是水解鞣質(zhì)中的一種，水解后可產(chǎn)生鞣花酸(逆沒食子酸，Ellagic acid)，廣泛存在于石榴、草莓、藍(lán)莓等食物中。隨著人們對其研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)其具有抗氧化、抗病毒、抗炎、雌激素受體拮抗等諸多生物活性[22-25]，人們進(jìn)一步對其在體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其主要代謝產(chǎn)物尿石素(urolithins)同樣具有較強(qiáng)的生物活性[26-28]，推測尿石素可能是鞣花鞣質(zhì)在體內(nèi)發(fā)揮作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。地榆中含有大量的鞣質(zhì)類成分，主要是水解鞣質(zhì)和縮合鞣質(zhì)，其水解鞣質(zhì)中就包含沒食子鞣質(zhì)和鞣花鞣質(zhì)[2]。通過對其代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析，可推測地榆鞣質(zhì)在體內(nèi)的代謝轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，進(jìn)一步闡明了其發(fā)揮作用的機(jī)理。接下來將對其代謝產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步活性研究，為新藥的開發(fā)利用提供依據(jù)。

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MetabolitesofTanninsfromSanguisorbaofficinalisL.inRatUrine

ZHOUBenhong1，2*，WANGJing1，WUYue1，YIHuilan1，TANJun2，ZHANGHongpan1

(1.Departmentofpharmaceutical，RenminHospitalofWuhanUniversity，Wuhan430060,China； 2.PharmaceuticalCollegeofWuhanUniversity，Wuhan430072,China)

Objective：To investigate the metabolites in urine of rats administrated with tannins extracted fromSanguisorbaofficinalisL.(STE) by gavage，liquid chromatography time of flight mass spectrometry (HPLC-TOF-MS) was employed.Methods：Rat’s urine samples were collected and analyze by liquid chromatography time of flight mass spectrometry (HPLC-TOF-MS).The analysis was performed on a ZORBAX Eclipse XDB-C18column with an acetonitrile-water gradient elution.Time of flight mass spectrometer (TOF/MS) was applied for qualitative analysis under negative ion mode.Based on the accurate molecular weight，MS and MS2information of TOF/MS detection and the compound list established previously，the possible metabolites of STE were identified.Results：Nine metabolites were detected in the rat urine：pyrogallol (M1)，urolithin B (M2)，methyl-urolithin C (M3)，urolithin A (M4)，methyl-urolithin A (M5)，urolithin C-clucuronidation (M6)，dimethy-EA (M7)，urolithin M5 (M8)，gallic acid (M9).M9 was the prototype drug.Conclusion：Tannins fromS.officinalisset off I phase metabolic reactions first to generate weak polarity metabolites such as urolithins after enteringinvivo，then the II phase reaction were happened to combined with glucuronide to increase its polarity，so as to excrete out through urine，which further clarifies the function mechanism of tannins fromS.officinalis.

Tannins；SanguisorbaofficinalisL.；metabolites；urolithins；HPLC-MS

] 周本宏，博士，教授，主任藥師，研究方向：中藥及天然藥物活性成分；E-mail：benhongzh@whu.edu.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.6.011

2016-08-20)

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