秦七風(fēng)濕方水提液和醇提液對巨噬細(xì)胞功能的影響△

周瑞，劉東，唐志書*，宋忠興，桂蓁蓉，葛秋萍，陳永琴

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué) 陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心 陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 咸陽 712083；2.咸陽市實(shí)驗(yàn)中學(xué)，陜西 咸陽 712000)

·基礎(chǔ)研究·

秦七風(fēng)濕方水提液和醇提液對巨噬細(xì)胞功能的影響△

周瑞1，劉東1，唐志書1*，宋忠興1，桂蓁蓉2，葛秋萍2，陳永琴2

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué) 陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心 陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 咸陽 712083；2.咸陽市實(shí)驗(yàn)中學(xué)，陜西 咸陽 712000)

目的：研究秦七風(fēng)濕方水提液和醇提液對巨噬細(xì)胞RAW264.7增殖和分泌一氧化氮(NO)的影響。方法：采用水煎煮和乙醇超聲分別制備秦七風(fēng)濕方水提液和醇提液，通過HPLC測定水提液和醇提液指標(biāo)性成分含量；利用CCK-8研究水提液和醇提液對RAW264.7增殖的影響；通過Greiss法測定水提液和醇提液對巨噬細(xì)胞分泌NO的影響。結(jié)果：含量測定發(fā)現(xiàn)醇提液的指標(biāo)性成分含量高于水提液，說明不同提取溶劑所得秦七風(fēng)濕方指標(biāo)性成分具有差異；水提液和醇提液對RAW264.7增殖的影響呈現(xiàn)濃度依賴性，具有促進(jìn)和抑制的作用；水提液和醇提液對LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞分泌NO具有顯著的抑制作用。結(jié)論：通過研究發(fā)現(xiàn)秦七風(fēng)濕方水提液和醇提液對RAW264.7增殖和分泌NO均具有一定的影響，呈現(xiàn)濃度依賴性，并且初步證實(shí)了水提液和醇提液均具有一定的抗炎活性，為將其發(fā)展為治療RA的臨床新藥提供理論參考。

秦七風(fēng)濕方；巨噬細(xì)胞；一氧化氮

2.XianyangShiShiyanMiddleSchool，Xianyang712000，China)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一種累及周圍關(guān)節(jié)為主的炎癥性自身免疫疾病，屬中醫(yī)“痹癥”范疇[1-2]。目前臨床上用于治療RA的化學(xué)藥主要有非甾體抗炎藥、糖皮質(zhì)類激素類藥，由于這些藥物長期服用會引起肝腎損害等毒副作用，達(dá)不到理想的治療效果[3]。以辨證論治為主的中藥復(fù)方在抗RA方面具有良好的抗炎、鎮(zhèn)痛及免疫調(diào)節(jié)等作用[4]。組方自陜西太白“七”藥的秦七風(fēng)濕方是由珠子參、秦艽、山茱萸組成，是陜西中醫(yī)藥大學(xué)楊秀清教授的臨床經(jīng)驗(yàn)方，在臨床上以湯劑應(yīng)用多年，已被證實(shí)具有益氣養(yǎng)陰、祛風(fēng)止痛之功效，對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎具有顯著療效。秦七風(fēng)濕方中珠子參(扣子七)為五加科人參屬植物，為方中君藥，已被證實(shí)具有多種藥理活性[5]。《全國中草藥匯編》中記載“珠子參主治跌打損傷、風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、胃痛，外用治外傷出血?！鼻剀淳哂行灾雇?、舒筋活絡(luò)之功效，已被應(yīng)用于多個治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的復(fù)方制劑中[6]。《本經(jīng)》中指出秦艽“主寒熱邪氣、寒熱風(fēng)痹，肢節(jié)痛。”《別錄》中提到秦艽“功在舒經(jīng)通絡(luò)，流利關(guān)節(jié)，惟治痹痛痙攣之癥。”秦艽與方中君藥珠子參相伍，協(xié)同君藥通痹止痛，為方中臣藥。山茱萸具有多種藥理活性[7]，已有研究發(fā)現(xiàn)其對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎具有治療作用[8]。《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》中指出山茱萸“大能收斂元?dú)猓褡骶瘢虧?，斂正氣而不斂邪氣”，《本?jīng)》中指出其具有逐寒濕痹的作用。山茱萸為方中佐使藥，一方面協(xié)同君臣之味，以逐寒濕痹痛；另一方面山茱萸具有補(bǔ)肝腎、斂元?dú)?、振作精神之效，與具有補(bǔ)肺養(yǎng)陰之功的珠子參相伍，共同達(dá)到補(bǔ)益肺腎之氣、養(yǎng)肺腎之陰的作用，使元?dú)獬涫?、氣血流暢、痹痛自除；另外山茱萸又酸斂固脫，防珠子參、秦艽濕燥之性。秦七風(fēng)濕方中雖三藥相伍，但配伍精當(dāng)，補(bǔ)而不膩，溫而不燥，涼而不寒，環(huán)環(huán)入扣，共奏益氣養(yǎng)陰、補(bǔ)益肺腎、舒經(jīng)通絡(luò)、宣痹止痛之效，達(dá)到了元?dú)獬涫?，風(fēng)、寒、濕、熱痹自愈的目的。由于該方作用于RA的機(jī)制尚不清楚，限制了其廣泛應(yīng)用。

巨噬細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)不可缺少的功能細(xì)胞，在RA的病理進(jìn)程中起著重要的作用[9]。巨噬細(xì)胞能夠一方面迅速識別并清除如病原微生物和變異自身產(chǎn)物，同時也能夠?qū)⑺淌傻奈镔|(zhì)進(jìn)行降解，將其中的抗原遞呈給T淋巴細(xì)胞，執(zhí)行抗原遞呈細(xì)胞的功能。巨噬細(xì)胞發(fā)揮吞噬和細(xì)胞內(nèi)降解作用，均離不開其被活化后分泌的一氧化氮(nitric oxide，NO)及一系列細(xì)胞因子的作用。NO是巨噬細(xì)胞對病原體和腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生毒活性的效應(yīng)分子，活化的巨噬細(xì)胞通過分泌NO進(jìn)一步介導(dǎo)機(jī)體的炎癥反應(yīng)[10]。課題組前期基于分離技術(shù)對秦七風(fēng)濕方的制備[11]、指標(biāo)性成分差異[12]及物理化學(xué)[13]進(jìn)行了研究。本文采用水溶液提取和醇溶液提取，開展秦七風(fēng)濕方水提液和醇提液的指標(biāo)性成分含量測定，并進(jìn)一步研究了秦七風(fēng)濕方水提液和醇提液對巨噬細(xì)胞增殖和分泌NO的影響，闡明不同提取技術(shù)制備的秦七風(fēng)濕方指標(biāo)性成分差異，初步證明秦七風(fēng)濕方的抗炎活性，為將其發(fā)展為治療RA的臨床藥物提供理論參考。

1 材料與儀器

1.1 材料

試驗(yàn)用珠子參、秦艽、山茱萸飲片均購于西安盛興中藥飲片有限公司，符合《中華人民共和國藥典》2015版相關(guān)規(guī)定；對照品竹節(jié)參皂苷Ⅳa、莫諾苷、龍膽苦苷和馬錢子苷(中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用，批號依次為20140518、20151024、20151021、20141108)；甲醇、乙腈均為色譜純，其余試劑均為分析純。

1.2 儀器

HH-2型電熱恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司)；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；OSB-2100油浴鍋(上海愛朗儀器有限公司)；Aglient Hplc.1260；Aglient 7C-C18(2)；FW-1000AD高速萬能粉碎機(jī)；FA21040N型電子天平(德國塞多利斯公司)；D101型電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京科偉永鑫實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備廠)；GQ76管式分離機(jī)(上海市離心機(jī)械研究所有限公司)。

2 方法

2.1 秦七風(fēng)濕方的提取

2.1.1 水提取液制備 按照處方比例稱取秦七風(fēng)濕方藥材共400 g，置1000 mL燒杯中，加入一定量的水共煎煮3次，每次煎煮2 h，過濾，合并濾液，并將所得濾液濃縮至400 mL量瓶中定容，得到質(zhì)量濃度為1 g·mL-1的生藥，所得的藥液置于高速離心機(jī)內(nèi)，20 000 r·min-1離心15 min，棄去沉淀物，將上清液冷凍干燥為干粉，備用。

2.1.2 醇提取液制備 按照處方比例稱取秦七風(fēng)濕方藥材共400 g，將藥品進(jìn)行粉碎，分置兩個500 mL錐形瓶中，加入一定量的乙醇共超聲3次，每次超聲30 min，抽濾，對濾液進(jìn)行旋蒸，直至成油狀物，放置在陰涼處進(jìn)行保存，備用。

2.2 HPLC測定各指標(biāo)

2.2.1 HPLC測定竹節(jié)參皂苷IVa含量 色譜柱：Agilent TC-C18(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)；檢測波長：203 nm；流速：1.0 mL·min-1；流動相：乙腈-0.2%磷酸(35∶65)；柱溫：25 ℃。理論塔板數(shù)按竹節(jié)參皂苷IVa峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000[14]271-272。

2.2.2 HPLC測定龍膽苦苷含量 色譜柱：Agilent TC-C18(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)；檢測波長：254 nm；流速：1.0 mL·min-1；流動相：乙腈-0.1%醋酸溶液(35∶65)；柱溫：25 ℃。理論塔板數(shù)按龍膽苦苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3000[14]270-271。

2.2.3 HPLC測定馬錢苷和莫諾苷含量 色譜柱：Agilent TC-C18(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)；檢測波長：240 nm；流速：mL·min-1；流動相：0～20 min，乙腈-0.3%磷酸溶液(7∶93)，20～50 min，乙腈-0.3%磷酸溶液(7→20∶93→80)；柱溫：25 ℃。理論塔板數(shù)按馬錢苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3000[14]27-28。

2.2.4 對照品溶液的制備 精密稱取對照品竹節(jié)參皂苷IVa、龍膽苦苷、馬錢子苷及莫諾苷適量，配制成1.0 g·L-1的對照品溶液，備用。

2.2.5 供試品溶液的制備 精密稱取適量的秦七風(fēng)濕方水提液和醇提液藥品干粉，配成1.0 g·L-1的溶液，過0.22 μm無機(jī)過濾膜，取續(xù)濾液備用。

2.3 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

2.3.1巨噬細(xì)胞RAW264.7的培養(yǎng) 小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7(上海中科院細(xì)胞庫)，培養(yǎng)RAW264.7 的完全培養(yǎng)基組成為 90%RPMI1640培養(yǎng)基、10%胎牛血清及1% 100 U·mL-1、100 mg·L-1青鏈霉素，培養(yǎng)條件為37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱。

2.3.2 細(xì)胞活力測定 將培養(yǎng)良好的巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞傳代接種于96孔板中(2×105個細(xì)胞/孔)，放入37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，之后棄去上清液，設(shè)對照組(無血清培養(yǎng)基)、加藥組。各加藥組分別加入5～1000 mg·L-1的水提藥液和醇提藥液，24 h后，向各孔中加入0.5 mg·L-1CCK-8試劑，1 h后用酶標(biāo)儀在450 nm波長處檢測其吸光值。

2.3.3 秦七風(fēng)濕方對巨噬細(xì)胞分泌NO的影響 將培養(yǎng)良好的巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞傳代接種于96孔板中(2×105個細(xì)胞/孔)，4 h之后棄去上清液，設(shè)對照組(無血清培養(yǎng)基)、加藥組。各加藥組分別加入含有5～1 000 mg·L-1的水提液和醇提液的無血清培養(yǎng)基，24 h后，取細(xì)胞上清液50 μL。利用Griess法測定NO的濃度，取50 μL細(xì)胞上清置于96孔板中，先給各孔加入50 μL磺胺(Sulfanilamide，Sul)，再加入50 μL萘基乙烯己二胺(N-1naphthylethylenediamine dihydrochloride，NED)試劑，用酶標(biāo)儀在550 nm波長處檢測其吸光度值。

2.3.4 秦七風(fēng)濕方對LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞分泌NO的影響 將培養(yǎng)良好的RAW264.7細(xì)胞進(jìn)行傳代接種于96孔板中(細(xì)胞數(shù)：2×105個/孔)，4 h后棄去上清液，設(shè)對照組(無血清培養(yǎng)基)、LPS組(1 mg·L-1LPS )、LPS加藥組(1 mg·L-1LPS+不同濃度各藥品)。先給各加藥組孔中加入不同濃度的秦七風(fēng)濕方水提和醇提藥液，孵育2 h后，再加入 1 mg·L-1LPS，20 h后取細(xì)胞上清液，利用Griess法測定NO的生成(步驟見2.3.3)。

3 結(jié)果

3.1 HPLC法測定秦七風(fēng)濕方各指標(biāo)性成分含量

通過HPLC測定秦七風(fēng)濕方水提液和醇提液中竹節(jié)參皂苷Ⅳa、龍膽苦苷、馬錢子苷、莫諾苷的含量，結(jié)果見表1，除馬錢子苷之外，醇提液各指標(biāo)性成分含量均高于水提液。

表1 秦七風(fēng)濕方水提液和醇提液各指標(biāo)性成分含量 %

3.2 秦七風(fēng)濕方水提液和醇提液對巨噬細(xì)胞增殖的影響

秦七風(fēng)濕方水提液(ST)對RAW264.7增殖的影響，結(jié)果如圖1 A所示，與對照組(Ctrl)相比，5 mg·L-1的水提液表現(xiàn)出促增殖的作用(***P<0.001)，10～25 mg·L-1水提液對細(xì)胞增殖無顯著影響(NS)，當(dāng)質(zhì)量濃度高于50 mg·L-1，水提液對細(xì)胞增殖表現(xiàn)出不同程度的抑制作用(*P<0.05，*P<0.01，***P<0.001)，1000 mg·L-1水提液對細(xì)胞增殖的抑制率達(dá)91.7%。醇提液(CT)對RAW264.7增殖的影響如圖1 B所示，與對照組(Ctrl)相比，5～25 mg·L-1的醇提液對細(xì)胞增殖無明顯影響(NS)，50～500 mg·L-1醇提液對細(xì)胞增殖表現(xiàn)出不同程度的促進(jìn)作用(*P<0.05，*P<0.01，***P<0.001)，1 000 mg·L-1醇提液抑制細(xì)胞增殖，抑制率為34.2%。由此結(jié)果可知，秦七風(fēng)濕方水提液和醇提液對巨噬細(xì)胞增殖具有促進(jìn)或者抑制作用，影響呈現(xiàn)濃度依賴性。在相同質(zhì)量濃度下，以1 000 mg·L-1為例，秦七風(fēng)濕方水提液對巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出比醇提液更大的毒性，導(dǎo)致此結(jié)果的原因還有待進(jìn)一步研究。

注：A.水提液；B.醇提液；*P < 0.05，*P< 0.01， ***P< 0.001；下同。圖1 秦七風(fēng)濕方對巨噬細(xì)胞增殖的影響

3.3 秦七風(fēng)濕方水提液和醇提液對巨噬細(xì)胞自身分泌NO的影響

利用Greiss法測定了秦七風(fēng)濕方水提液和醇提液對巨噬細(xì)胞分泌NO的影響。結(jié)果如圖2A所示，與對照組(Ctrl)相比，25～100 mg·L-1的水提液對巨噬細(xì)胞自身分泌NO無顯著影響(NS)，250 mg·L-1水提液對細(xì)胞自身分泌NO具有抑制作用(*P< 0.05)；另外，25～250 mg·L-1醇提液對細(xì)胞分泌NO具有顯著的抑制作用(*P< 0.05，*P< 0.01，***P< 0.001)，高濃度的醇提液(500 mg·L-1)無顯著影響(NS)(見圖2 B)。此結(jié)果表明醇提液與水提液對細(xì)胞自身分泌NO的影響不同，很可能是由于兩者成分的差異導(dǎo)致的，還需要進(jìn)一步的研究證實(shí)不同提取方法對秦七風(fēng)濕方生物活性的影響。

圖2 秦七風(fēng)濕方對巨噬細(xì)胞分泌NO的影響

3.4 秦七風(fēng)濕方水提液和醇提液對LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞分泌NO的影響

通過秦七風(fēng)濕方水提液和醇提液對巨噬細(xì)胞增殖以及自身分泌NO的影響，篩選出了質(zhì)量濃度5、10、25 mg·L-1，進(jìn)一步研究秦七風(fēng)濕方水提液和醇提液對脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞分泌NO的影響，初步探索其抗炎活性。與空白對照相比，各個組產(chǎn)出NO的相對值結(jié)果如圖3所示，1 mg·L-1的LPS可以顯著激活巨噬細(xì)胞分泌NO(A，B)，5、10、25 mg·L-1的水提液和醇提液對LPS誘導(dǎo)的NO生成具有顯著的抑制作用，并且呈現(xiàn)濃度依賴性(***P<0.001)，通過計(jì)算得出不同濃度水提液對LPS誘導(dǎo)的NO抑制率分別為51%、58%、77%，醇提液的抑制率為57%、59%、77%。由此結(jié)果可以看出，在低質(zhì)量濃度(5 mg·L-1)時醇提液的抑制活性更為明顯，而高質(zhì)量濃度下水提液和醇提液對LPS誘導(dǎo)的NO抑制活性無明顯差異，表明秦七風(fēng)濕方水提液和醇提液均對LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥模型表現(xiàn)出一定的抗炎活性。NO只是機(jī)體的炎癥介質(zhì)之一，要深入探索秦七風(fēng)濕方的抗炎活性還需要進(jìn)一步的研究。

圖3 秦七風(fēng)濕方LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞分泌NO的影響

4 結(jié)論

秦七風(fēng)濕方是由珠子參、秦艽、山茱萸3味中藥組成，在臨床已應(yīng)用多年，已被證實(shí)具有益氣養(yǎng)陰、祛風(fēng)止痛的作用，對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎具有顯著療效。本文采用HPLC研究秦七風(fēng)濕方水提液和醇提液指標(biāo)性成分含量，發(fā)現(xiàn)了已測的4個指標(biāo)性成分，除馬錢子苷外，在醇提液中的含量均大于水提液，這很有可能是由于水提取能夠提出更多水溶性的多糖及大分子成分，而導(dǎo)致指標(biāo)性成分含量相對較低。通過細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)秦七風(fēng)濕方水提液和醇提液對巨噬細(xì)胞增殖呈現(xiàn)顯著的質(zhì)量濃度依賴性，隨著質(zhì)量濃度的變化，對巨噬細(xì)胞具有一定的促增殖和抑制增殖的作用。并且在相同質(zhì)量濃度下，秦七風(fēng)濕方水提液比醇提液對增殖抑制作用更為明顯，引起此結(jié)果的原因還有待進(jìn)一步研究。本文研究還發(fā)現(xiàn)水提液各濃度對巨噬細(xì)胞自身分泌NO影響不大，而醇提液低濃度表現(xiàn)出抑制NO的作用，表明在相同質(zhì)量濃度下，秦七風(fēng)濕方醇提液對巨噬細(xì)胞自身分泌NO的影響更為明顯。最后，通過LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞構(gòu)建炎癥細(xì)胞模型，我們初步證明了秦七風(fēng)濕方水提液和醇提液各濃度對LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞分泌NO具有顯著的抑制作用，此抑制作用呈現(xiàn)濃度依賴性。有趣的是在一定的質(zhì)量濃度下，秦七風(fēng)濕方醇提液對巨噬細(xì)胞增殖、自身分泌NO以及LPS誘導(dǎo)的NO均表現(xiàn)出優(yōu)于水提液的活性，導(dǎo)致此結(jié)果的原因是否是由于醇提液中已測的指標(biāo)性成分竹節(jié)參皂苷Ⅳa、龍膽苦苷、莫諾苷含量高于水提液，還需要進(jìn)一步研究證實(shí)。本文結(jié)果表明秦七風(fēng)濕方水提液和醇提液均具有一定的抗炎活性，并且呈現(xiàn)質(zhì)量濃度依賴性。本文的研究為將秦七風(fēng)濕方發(fā)展為治療RA的臨床新藥提供理論參考。

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EffectofQinqiRheumatismFormulaAqueousExtractandEthanolExtractonCellFunctionofMacrophage

ZHOURui1，LIUDong1，TANGZhishu1*，SONGZhongxing1，GUIZhenrong2，GEQiuping2，CHENYongqin2

(1.ShaanxiUniversityofChineseMedicine/ShaanxiCollaborativeInnovationCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrialization/ShaanxiProvinceKeyLaboratoryofNewDrugsandChineseMedicineFoundationResearch，Xianyang712083，China；

Objective：To study the effect of Qinqi Rheumatism formula aqueous extract and ethanol extract on the proliferation and production of nitric oxide (NO) with RAW264.7 macrophage.Methods：Qinqi Rheumatism formula aqueous extract and ethanol extract were prepared through aqueous decoction and ethanol ultrasonic respectively，the index components of aqueous extract and ethanol extract were detected by HPLC.The effect of aqueous extract and ethanol extract on the proliferation of RAW264.7 was evaluated using the CCK-8 assay.The effect of aqueous extract and ethanol extract on the secretion of NO was measured by the Griess reaction method.Results：The index components of ethanol extract were higher than those of aqueous extract，which showed the differences of the index components of Qinqi Rheumatism formula prepared by different extraction solvents.The aqueous extract and ethanol extract promoted or inhibited the proliferation of RAW264.7 in a dose-dependent manner.The inhibitory effect of the aqueous and ethanol extract in the production of NO in LPS-stimulated RAW264.7 was found.Conclusion：The effects of the aqueous extract and ethanol extract of Qinqi Rheumatism formula on the proliferation and secretion of NO in RAW264.7 was found in a dose-dependent manner，and the anti-inflammatory activity of aqueous extract and ethanol extract was confirmed preliminarily.This study will provide theoretical basis for developing Qinqi Rheumatism formula as a new drug for the treatment of RA.

Qinqi Rheumatism formula；macrophage；nitric oxide

陜西省教育廳專項(xiàng)科研計(jì)劃項(xiàng)目(16JK1214)；陜西省重點(diǎn)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(2012KTC-20)；陜西省科技資源開放共享平臺項(xiàng)目(2015FWPT-01)

] 唐志書，教授，研究方向：中藥新產(chǎn)品研發(fā)與中藥制備新技術(shù)的應(yīng)用研究；Tel:(029)38185060，E-mail:tzs6565@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.6.010

2016-10-20)

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