番茄紅素對人肝癌HepG2細胞生長的影響及其機制△

趙孟雷

(邯鄲市中心醫院，河北 邯鄲 056001)

·基礎研究·

番茄紅素對人肝癌HepG2細胞生長的影響及其機制△

趙孟雷*

(邯鄲市中心醫院，河北 邯鄲 056001)

目的：研究番茄紅素(Lycopene，LP)對人肝癌HepG2細胞生長的抑制作用及其機制。方法：體外培養并取對數生長期人肝癌HepG2細胞，分別給予不同質量濃度LP(5、10、20 μg·mL-1)和順鉑(40 μg·mL-1)進行干預，48 h后通過MTT比色法測定細胞增殖抑制率，通過流式細胞術檢測細胞周期和細胞凋亡狀況，采用Western blotting技術檢測Bax、bcl-2、Cleaved Caspase-3蛋白表達。結果：經LP或順鉑干預48 h能夠有效提高人肝癌HepG2細胞增殖抑制率，延長細胞周期G0/G1期并縮短G2/M期，提高細胞凋亡率(Apoptosis Index，AI)，上調Bax表達、下調bcl-2表達、提高Bax/bcl-2比值，上調Cleaved Caspase-3蛋白表達，LP上述作用均具有一定的劑量依賴性。結論：LP能夠通過抑制細胞增殖并促進其凋亡而對人肝癌HepG2細胞生長具有一定的抑制作用，其機制可能與LP能夠影響細胞周期進程并調節凋亡相關基因蛋白表達有關。

番茄紅素；肝癌；HepG2細胞；生長；抑制

肝癌是發病率最高的惡性腫瘤之一，肝癌具有發病隱匿、發展迅速、轉移及侵襲能力強、惡性度高的特點[1-2]，我國每年約11萬人死于肝癌，居惡性腫瘤致死率第二位，急需研究能夠有效控制肝癌進展和復發的新型藥物和新的治療方案。番茄紅素(Lycopene，LP)是一種具有抗氧化、降低血糖、增強機體免疫力等多種生物學活性的胡蘿卜素[3-6]，且近年來LP抗腫瘤作用也逐漸得到廣大醫藥工作者的關注，既往研究發現番茄紅素對肺癌、胃癌、前列腺癌、卵巢癌等均具有一定的抑制作用[7-10]，茄紅素是否對肝癌具有治療作用尚未見文獻報道，本實驗將通過體外培養人肝癌HepG2細胞并給予LP進行干預，探討番茄紅素對肝癌細胞生長的影響并探討其作用機制。

1 材料

人肝癌HepG2細胞株(河北醫科大學細胞生物研究室)；番茄紅素(南京澤朗生物科技有限公司，純度≥96%)；注射用順鉑(山東齊魯制藥有限公司)；DMEM 高糖培養基、胰蛋白酶、胎牛血清(Gibco公司)；MTT(Sigma公司)；Annexin V/PI細胞凋亡檢測試劑盒(BD公司)；bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3單克隆抗體(碧云天生物技術有限公司)。

2 方法

2.1 細胞培養、分組與給藥

人肝癌HepG2細胞株經復蘇后植入DMEM高糖培養基進行培養并取對數生長期細胞進行下一步實驗：0.25%胰酶消化、調整細胞濃度為5×104·mL-1后分為空白對照組、番茄紅素組(5、10、20 μg·mL-1)和順鉑組(40 μg·mL-1)[11]，n=10；各組細胞繼續培養24 h后分別給予相應濃度藥物進行干預，48 h后進行各指標檢測。

2.2 各組HepG2細胞增殖抑制率的測定

調整細胞濃度至5×104·mL-1，接種于96孔板，每孔滴加20 μL MTT溶液(5 mg·mL-1)，培養4 h后去上清液，加入DMSO 200 μL，振蕩10 min后通過酶標儀測定波長570 nm處吸光度(A)值，計算各組HepG2細胞增殖抑制率：細胞增殖抑制率(%)=[1-(A實驗組-A空白組)/(A對照組-A空白組)]×100%。

2.3 細胞周期的檢測和細胞凋亡狀況的觀察

各組細胞經PBS洗滌，加入70%乙醇水5 mL，混勻并置4 ℃環境48 h培養后離心取細胞，經PBS洗滌并打散細胞團后加5μL水解酶Rnase(10 mg·mL-1)，置37 ℃環境1 h，加入碘化丙啶染液，避光孵育30 min，然后通過流式細胞儀進行檢測，采用CELL Quest軟件分析各組細胞的細胞周期時相及凋亡狀況。

2.4 各組HepG2細胞bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表達的檢測

各組細胞經PBS溶液洗滌后行超聲裂解，低溫離心(4 ℃，12 000 r·min-1，20 min)取沉淀，采用BCA法測定蛋白濃度，蛋白變性(沸水浴加熱5 min)、上樣(每孔上樣30 μg)，經SDS-PAGE凝膠電泳后轉PVDF膜、室溫下5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗(bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3，β-actin)4 ℃過夜，洗膜，二抗(1∶100)室溫孵育1 h后經ECL系統顯影；以β-actin為內參，以條帶灰度值測定bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3表達相對量。

2.5 統計學方法

運用軟件SPSS15.0進行統計分析，組間均數比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 LP對人肝癌HepG2細胞增殖抑制率的影響

MTT比色法檢測結果見表1，經番茄紅素或順鉑干預48 h能夠顯著提高人肝癌HepG2細胞增殖抑制率，且番茄紅素對HepG2細胞的增殖抑制作用具有一定的劑量依賴性；番茄紅素20 μg·mL-1組細胞增殖抑制率顯著高于順鉑組。

表1 LP對人肝癌HepG2細胞增殖抑制率的影響

注：與空白對照組比較,*P<0.05，**P<0.01；與順鉑組比較,△P<0.05，△△P<0.01；下同。

3.2 LP對人肝癌HepG2細胞周期的影響

流式細胞術檢測結果見表2，經番茄紅素干預48 h能夠顯著延長人肝癌HepG2細胞周期G0/G1期、縮短S期和G2/M期，其中番茄紅素20 μg·mL-1組較空白對照組和順鉑組均具有統計學差異；提示番茄紅素能夠阻滯細胞周期而起到抑制細胞增殖的作用。

表2 LP對人肝癌HepG2細胞周期的影響

3.3 LP對人肝癌HepG2細胞凋亡狀況的影響

流式細胞術檢測結果見圖1，經番茄紅素或順鉑干預48 h，能夠誘導人肝癌HepG2細胞凋亡，數量明顯增多，番茄紅素誘導細胞凋亡的作用具有一定的劑量依賴性。各組細胞凋亡指數(AI)結果見表3，經番茄紅素或順鉑干預48 h能夠有效提高人肝癌HepG2細胞AI，且番茄紅素20 μg·mL-1組人肝癌HepG2細胞AI顯著高于順鉑組。

注：A.空白對照組；B.番茄紅素5 μg·mL-1組；C.番茄紅素10 μg·mL-1組；D.番茄紅素20 μg·mL-1組；E.順鉑40 μg·mL-1組。圖1 LP對人肝癌HepG2細胞凋亡狀況的影響

組別AI(%) 空白對照組36±17番茄紅素5μg·mL-1組195±48??番茄紅素10μg·mL-1組430±92??番茄紅素20μg·mL-1組676±101??△△順鉑40μg·mL-1組369±68??

3.4 LP對人肝癌HepG2細胞bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表達的影響

采用Western blotting法檢測并通過灰度值進行半定量分析，結果見圖3、表5，經番茄紅素或順鉑干預48 h能夠顯著上調人肝癌HepG2細胞bcl-2、Cleaved Caspase-3蛋白表達，顯著提高Bax/bcl-2比值；番茄紅素該作用具有一定的劑量依賴性；其中番茄紅素20 μg·mL-1組bcl-2 mRNA表達較順鉑組顯著降低，Bax/bcl-2比值顯著升高，Cleaved Caspase-3蛋白表達量顯著升高。

注：A.空白對照組；B.番茄紅素5 μg·mL-1組；C.番茄紅素10 μg·mL-1組；D.番茄紅素20 μg·mL-1組；E.順鉑40 μg·mL-1組。圖3 LP對人肝癌HepG2細胞bcl-2、Bax、 Cleaved Caspase-3蛋白表達的影響

組別bcl?2/β?actinBax/β?actinBax/bcl?2CleavedCaspase?3/β?actin空白對照組059±017018±006031±012008±003番茄紅素5μg·mL-1組046±013027±010058±017?025±007??番茄紅素10μg·mL-1組042±009?043±014??102±039??034±011??番茄紅素20μg·mL-1組027±008??076±019??281±085??△△046±018??△順鉑40μg·mL-1組034±011?031±009??091±040??017±005?

4 討論

目前臨床上對于肝癌的治療主要采取手術切除結合術后放化療的綜合治療方案[12]，但大多數患者就診時已達病程中晚期、失去手術機會，目前臨床上手術切除率僅為20%[13]，5年復發率高達60%以上[14]，嚴重危害著人類的生命健康，以抑制腫瘤細胞生長為切入點研究新型抗腫瘤藥物成為提高臨床療效的新思路。

LP是一種具有廣泛生物學活性的萘醌類化合物[3-10]，張玉江等[7]研究發現番茄紅素能夠抑制人肺癌H520細胞的侵襲和遷移而抑制肺癌細胞的擴散；范現英等[8]總結分析發現LP具有增強機體免疫力、誘導胃癌細胞凋亡的作用；張鑫等[9]研究發現LP能夠抑制前列腺癌LnCaP細胞增殖；于海榮等[15]研究發現LP能夠通過改變膜電位以及促進內源性活性氧的生成而抑制人宮頸癌Hela細胞增殖；魯昊等[16]通過體外培養人喉癌Hep-2細胞并給予番茄紅素進行干預研究發現，LP能夠通過改變細胞周期而起到抑制Hep-2細胞增殖的作用。本研究發現經LP干預治療48 h能夠顯著提高人肝癌HepG2細胞增殖抑制率，能夠將人肝癌HepG2細胞阻滯于G0/G1期并提高細胞凋亡率，且LP 20 μg·mL-1劑量組細胞增殖抑制率和細胞凋亡率均顯著高于順鉑組；提示LP能夠通過抑制細胞增殖并促進其凋亡而對人肝癌HepG2細胞生長具有一定抑制作用。

細胞凋亡過程中Caspase和Bcl-2兩大基因家族發揮著非常重要的調控作用，其中caspase-3是激活各種凋亡刺激因子(Apaf-1)的關鍵蛋白酶，參與細胞凋亡的啟動及整個凋亡過程的調節；bcl-2能夠抑制線粒體破裂，可直接與Apaf-1結合而抑制caspase-3激活，抑制促凋亡蛋白Bax細胞毒性作用，調節細胞內鈣濃度，從而起到抑制細胞凋亡的作用[17]；Bax屬于Bcl-2基因家族成員，具有誘導線粒體滲透性改變而釋放細胞色素C、激活促凋亡蛋白caspase-9表現出促細胞凋亡作用[18]。此外，Bax能夠與bcl-2聚合成二聚體，從而抑制bcl-2活性促進細胞凋亡，所以Bax/bcl-2比值更加能夠體現Bcl-2基因家族對細胞凋亡的調控作用[19-20]。本研究發現，經LP干預能夠有效上調人肝癌HepG2細胞Bax蛋白表達、下調bcl-2蛋白表達并提高Bax/bcl-2比值，上調caspase-3蛋白表達，這可能是LP誘導人肝癌HepG2細胞凋亡的重要分子機制。

總之，LP能夠通過抑制細胞增殖并促進其凋亡而對人肝癌HepG2細胞生長具有一定抑制作用，其機制可能與LP能夠阻滯細胞周期并調節凋亡相關蛋白(caspase-3、Bax、bcl-2)表達有關。

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EffectsofLycopeneonGrowthofHumanHepG2Cell

ZHAOMenglei*

(HandanCentralHospital，Handan056001，China)

Objective：To investigate the effects of lycopene on the growth of human HepG2 cell.Methods：The human HepG2 cells in logarithmic growth phase was treated with lycopene (5，10，20 μg·mL-1) groups and cisplatin (40 μg·mL-1).The cellular growth inhibition rate was calculated by MTT，cell cycle and apoptosis rate were analyzed by flow cytometry，the expression of Bax，bcl-2 and cleaved caspase-3 protein was detected by western blotting.Results：The cellular growth inhibition rate of human HepG2 cell in lycopene treated groups and cisplatin treated group were significantly increased，the cell cycle was arrested at G0/G1phase，the apoptosis rate was significantly increased，the expression of Bax mRNA was significantly increased，while the expression of bcl-2 was significantly decreased，and the ratio of Bax/bcl-2 was significantly increased；the expression of Cleaved Caspase-3 protein was significantly increased；all of the effects of Lycopene above were dose-dependent with a certain.Conclusion：Lycopene has inhibitive effects on the growth of human HepG2 cells perhaps through inhibiting proliferation and inducing apoptosis；which perhaps related to its effects of altering the cell cycle and the expression of apoptosis-related genes and proteins.

Lycopene；hepatic carcinoma；HepG2 cell；growth；inhibitive effects

邯鄲市科學技術研究與發展計劃項目(1623208086ZC)

] 趙孟雷，主治醫師，研究方向：普外科疾病研究；E-mail：hdzhml@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.6.008

2016-11-13)

*[