依達拉奉注射液對高膽紅素血癥腦損傷新生大鼠血清S100B蛋白水平的影響

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依達拉奉注射液對高膽紅素血癥腦損傷新生大鼠血清S100B蛋白水平的影響

申雅潔1，陰懷清2，曹芳芳2，賈曉君2

目的依達拉奉注射液干預后對高膽紅素血癥腦損傷新生大鼠血清S100B蛋白濃度的影響。方法將96只7 d齡SD大鼠隨機分為正常對照組(A組)、高膽紅素血癥組(B組)、依達拉奉注射液干預組(C組)，每組根據處死時間分為4個亞組。給予B組、C組大鼠腹腔注入1次膽紅素，同樣方法給予A組大鼠注入1次生理鹽水，造模后C組大鼠立即腹腔注射依達拉奉注射液，最后在各時間點將各組大鼠血清及腦組織取出。采用HE染色法觀察腦組織的病理學改變，Elisa法測定血清S100B蛋白濃度，計算相關數據并進行統計學分析。結果造模后，明顯的神經行為異常均出現在B組和C組大鼠，各時間點C組大鼠較B組癥狀明顯改善，A組大鼠行為無明顯異常。造模24 h后，B組、C組大鼠腦組織出現水平不一的水腫、變性及炎性浸潤等，隨著時間延長程度加重。各時間點C組大鼠腦組織改變程度較B組減輕，A組大鼠腦組織結構基本正常。B組大鼠血清S100B蛋白濃度高于A組、C組，與時間呈正相關，差異有統計學意義(P<0.05)；C組大鼠血清S100B蛋白濃度低于B組，高于A組，差異有統計學意義(P<0.05)。結論經依達拉奉注射液干預后，不同時間點腦組織改變不同程度減輕，高膽紅素血癥大鼠血清S100B蛋白濃度明顯降低，表明依達拉奉注射液可減輕過量膽紅素對中樞神經系統的損傷，起到保護神經元作用。

高膽紅素血癥；腦損傷；依達拉奉注射液；S100B蛋白

黃疸是新生兒早期常見的臨床癥狀，多數較輕，約25/10萬的足月或近足月新生兒可發生較嚴重的高膽紅素血癥，輕者出現神經系統的功能性損傷如聽覺系統損傷，重者可引起急性膽紅素腦病，造成嚴重神經系統后遺癥，甚至危及生命[1-2]。高膽紅素血癥引起腦損傷早期無特異性臨床表現，多數新生兒出現典型癥狀前已發生神經毒性損害，臨床需要客觀及敏感指標判斷膽紅素對神經系統的損傷。本研究通過建立新生大鼠高膽紅素血癥動物模型，研究高膽紅素血癥時使用依達拉奉注射液干預后大鼠血清S100B蛋白的水平，為高膽紅素血癥的診治及臨床用藥提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組 將96只7 d齡以Sprague-Dawley(SD)大鼠隨機分為3組：正常對照組(A組)、高膽紅素血癥組(B組)、依達拉奉注射液干預組(C組)。每組根據處死時間不同分為4個亞組：24 h組、48 h組、72 h組、96 h組，每個亞組8只大鼠。

1.2 注射用膽紅素溶液及依達拉奉注射液溶液配制 避光稱取4 mg膽紅素晶體，溶于1 mL 0.5 mol/L NaOH溶液中，再加入雙蒸水9 mL，濃度為4 mg/mL，之后用0.5 mol/L HCl溶液將pH調至8.5，1 h內使用。取1支20 mL(30 mg)依達拉奉注射液溶液，使用生理鹽水稀釋至200 mL，濃度為0.15 mg/mL，避光保存。

1.3 造模及方法 采用腹腔注射方法給予B組、C組大鼠按100 μg/g劑量注入1次膽紅素，采用同樣方法給予A組大鼠按同樣劑量注入1次生理鹽水，造模后C組大鼠立即腹腔注射依達拉奉注射液，劑量為2 mg/(kg·d)，持續4 d。

1.4 標本制備 在不同時間點以5%水合氯醛將大鼠麻醉，將麻醉后大鼠固定于手術板上，逐一打開大鼠胸腔及腹腔，將心臟、肝臟充分暴露，以5 mL注射器小心刺入心臟跳動最明顯處，抽取血液0.5 mL于干燥EP管中，靜置30 min后以3 000 r/min離心10 min，用1 mL注射器小心吸出上層血清，移至另一干燥EP管中，置-80 ℃冰箱內保存用于檢測S100B蛋白，溶血標本除外。

在肝臟下緣剪一長約3 mm的小口，以20 mL注射器于心臟抽取血液同一位置刺入心臟，將生理鹽水注入左心室，進行充分灌洗，當肝臟下緣切口處有清亮液體流出時，再以20 mL～30 mL的10%多聚甲醛灌洗。灌洗結束后，將大鼠斷頭并剖出腦組織，采用生理鹽水清洗并以濾紙濾干水分，浸入10%多聚甲醛固定24 h，先行矢狀切，之后分別從視交叉及其后約4 mm處行冠狀切，將海馬區囊括其中，將組織塊行常規石蠟包埋，后將標本不間斷冠切于切片機上，片厚約5 μm，放于載玻片，最后切片于70 ℃烤箱中過夜。將大鼠腦組織HE染色，鏡下(10×10)觀察組織形態并采集圖像。

2 結 果

2.1 動物模型行為觀察 實驗前，B組、C組大鼠行為學表現未見明顯異常，隨著實驗時間延長，兩組大鼠皮膚黃染逐漸加重，對外界刺激的規避應激反應減弱，但各時間點C組大鼠行為學異常表現較B組顯著減輕。整個實驗過程，A組大鼠在行為學變現方面未見顯著異常。

2.2 HE染色觀察腦組織病理變化 造模24 h后，B組、C組大鼠腦組織出現水平不一的水腫、變性及炎性浸潤等，且隨著時間延長，其程度有所加重。與B組比較，C組不同時間點大鼠腦組織的水腫、變性及炎性浸潤等改變程度減輕，A組大鼠神經細胞結構基本正常。詳見圖1。

A組24 h B組24 h C組24 h

A組48 h B組48 h C組48 h

A組72 h B組72 h C組72 h

A組96 h B組96 h C組96 h

2.3 各組大鼠血清S100B蛋白濃度比較 B組大鼠血清S100B蛋白濃度高于A組，且與時間呈正相關，差異有統計學意義(P<0.05)；C組大鼠血清S100B蛋白濃度低于B組，高于A組，差異有統計學意義(P<0.05)；A組大鼠血清S100B蛋白濃度，各時間點組內比較，差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠血清S100B蛋白濃度比較(±s) pg/mL

3 討 論

黃疸是新生兒期常見的臨床癥狀之一，其程度不一。新生兒發生高膽紅素血癥后，過量的游離膽紅素通過血腦屏障進入中樞神經系統，其對中樞神經系統毒性分為聚集、結合、沉淀三個步驟，前兩個步驟對神經細胞損害是可逆的，而沉淀的損害是不可逆的。膽紅素沉積在腦組織，引起一系列病理生理改變，導致神經細胞壞死或凋亡，最終引起腦組織不同程度損壞[3-4]。由于高膽紅素血癥腦損傷早期無特異性臨床表現，導致治療的滯后性，因此，及時處理新生兒高膽紅素血癥是預防高膽紅素血癥腦損傷的關鍵[5]。

依達拉奉注射液(edaravone，MCI-186)是一種具有捕獲羥自由基(·OH)的活性抗氧劑。有研究表明，依達拉奉注射液脂溶性高，易到達腦組織，對腦缺血具有強大的保護作用，是一種有效的腦神經保護劑[6-7]。目前主要應用于急性腦梗死、缺血缺氧性腦病及各種缺血再灌注損傷的治療，通過調節腦缺血后單胺類物質代謝，清除自由基和抑制脂質過氧化，調節腦缺血后花生四烯酸代謝，保護血管內皮，對凋亡基因的影響保護神經元[13]。

S100B蛋白是S100蛋白家族中最主要且最具活性的蛋白質，在中樞神經系統中高度特異表達，正常情況下不能通過血-腦脊液屏障(BBB)，血清S100B蛋白濃度維持極低水平，當中樞神經系統損傷時，神經膠質細胞激活和表達增加，導致S100B蛋白分泌，并從損傷的星形膠質細胞釋放，使腦脊液S100B蛋白水平升高。若BBB損傷，S100B蛋白可釋放到全身血液循環，檢測到血液S100B蛋白濃度升高。因此血清和腦脊液S100B蛋白濃度升高，是檢測腦損傷的重要神經生化標記物[14-15]。

有研究結果表明，當患兒血清總膽紅素(TSB)≤191 μmol/L時，血清S100B蛋白穩定維持在固定水平，當膽紅素濃度進一步增高時，患兒出現聽覺、腦電圖異常，其血清S100B蛋白顯著增高；高膽紅素血癥新生兒血清中S100B蛋白明顯高于正常新生兒，且輕中度高膽紅素血癥引起S100B蛋白顯著增高，與膽紅素水平呈正相關性[16]。故S100B蛋白可作為臨床診斷新生兒高膽紅素血癥腦損傷的敏感指標，且與腦損傷程度有關。吳信真等[17]研究依達拉奉注射液對急性大面積腦梗死病人S100B蛋白水平影響，結果顯示對照組和治療組治療前S100B蛋白水平差異無統計學意義；治療10 d后兩組S100B蛋白水平較治療前均有下降，治療組低于對照組(P<0.05)[17]。表明大面積腦梗死后，由于腦組織缺血、缺氧、水腫及壞死等改變，導致神經元、神經膠質細胞損傷，同時由于BBB通透性增高或破壞，進入血清中的S100B蛋白含量明顯增高，依達拉奉注射液治療后血清中S100B蛋白含量明顯下降[18]。在大鼠全腦缺血再灌注模型中，依達拉奉注射液組大鼠血清S100B蛋白含量較缺血再灌注組顯著降低(P<0.05)。關于依達拉奉注射液治療高膽紅素血癥腦損傷方面研究較少。

本研究結果顯示，高膽紅素血癥時，24 h后大鼠腦組織出現水腫、變性及炎性浸潤等改變，且隨著時間延長，其程度有所加重；大鼠血清S100B蛋白濃度增高，與時間呈正相關。經依達拉奉注射液干預后，不同時間點大鼠腦組織的水腫、變性及炎性浸潤等有不同程度減輕，血清S100B蛋白濃度明顯降低，表明依達拉奉注射液通過減輕過量膽紅素對大鼠中樞神經系統的損傷，從而保護其神經元。

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(本文編輯薛妮)

Effects of Edaravone Injection on Serum S100B Protein in Neonatal Rats with Hyperbilirubinemia Induced Brain Injury

Shen Yajie，Yin Huaiqing，Cao Fangfang，Jia Xiaojun

Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，Shanxi，China

ObjectiveTo explore the effects of edaravone injection on serum S100B protein in neonatal rats with hyperbilirubinemia induced brain injury.MethodsNinety-six seven-day-old Wistar Sprague-Dawley (SD) rats were randomly assigned into three groups:normal control group (group A)，hyperbilirubinemia group (group B)，and edaravone injection group (group C).Then each group was divided into 4 subgroups based on the time of execution.The rats in group B and group C were injected intraperitoneally with bilirubin.The rats in group A were injected intraperitoneally with normal saline once.After modeling，rats in group C were given intraperitoneal injection of edaravone injection.The serum and brain tissue were taken out at different time points.The pathological changes of brain tissue were observed by HE staining.The concentration of serum S100B protein was measured by Elisa method.ResultsAfter modeling，neurological abnormalities were observed in group B and group C.The symptoms of rats in group C had significantly improved compared with group B at each time point.After 24 hours of modeling，the edema，degeneration and inflammatory infiltration of brain tissue in group B and group C were aggravated with the prolongation of time.The changes of brain tissue in group C were lower than those in group B at each time point.The structure of brain tissue in group A was normal.The concentration of S100B protein in group B was higher than that in group A and group C，and positively correlated with time (P<0.05).The concentration of serum S100B protein in group C was lower than that in group B (P<0.05).ConclusionAfter intervention with edaravone injection，the changes of brain tissue in the hyperbilirubinemia rats at different time points were reduced to different degrees.The concentration of S100B protein was significantly decreased at different time points.The results indicated that edaravone injection could reduce the damage of excess bilirubin on central nervous system，and play a role in protecting neurons.

hyperbilirubinemia；brain injury；edaravone injection；S100B protein

山西省回國留學人員科研資助項目(No.2014-075)

1.山西醫科大學(太原 030001)，E-mail：418824956@qq.com；2.山西醫科大學第一醫院

信息：申雅潔，陰懷清，曹芳芳，等.依達拉奉注射液對高膽紅素血癥腦損傷新生大鼠血清S100B蛋白水平的影響[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2017，15(17)：2116-2119.

R722.1 R256.4

：Adoi：10.3969/j.issn.1672-1349.2017.17.009

：1672-1349(2017)17-2116-04

2017-01-15)