一只半野生病死川金絲猴腸道微生物多樣性分析

劉燕鄭常明李林海張成林*劉學鋒姚輝余輝亮李瑩楊明海賈婷盧巖夏茂華

(1.北京動物園，北京，100044；2.圈養野生動物技術北京市重點實驗室，北京，100044；3.國家林業局林產工業規劃設計院，北京，100010；4.湖北省金絲猴保護研究中心，神農架，442421)

一只半野生病死川金絲猴腸道微生物多樣性分析

劉 燕1，2鄭常明1，2李林海張成林1，2*劉學鋒1，2姚 輝4余輝亮李 瑩1，2楊明海1，2賈 婷1，2盧 巖1，2夏茂華1，2

(1.北京動物園，北京，100044；2.圈養野生動物技術北京市重點實驗室，北京，100044；3.國家林業局林產工業規劃設計院，北京，100010；4.湖北省金絲猴保護研究中心，神農架，442421)

稿件運行過程

川金絲猴； 腸道菌群； 多樣性分析； 投食群； 神農架

川金絲猴(Rhinopithecusroxellana)是中國特有的珍稀動物，具有極高的生態地位和研究價值，僅次于大熊貓，被譽為中國的第二國寶。神農架保護區內的川金絲猴種群相對孤立，主要包括大龍潭投食群和小龍潭圈養種群。大龍潭的猴群自2006年開始進行人工投食以來，種群數量正在逐年增加，種群內和種群間存在著個體遷移，近交水平較低，遺傳多樣性得以維持[1]。

本次死亡川金絲猴是1只老年雄性金絲猴，年齡在20歲左右。自2006～2015年間一直是大龍潭保護站投食種群中一個16只金絲猴家庭的家長。其在家庭中地位較為穩固，對家庭中雌性成員較好，與它們分享食物，幫它們梳理毛發，經常協助照顧幼猴，并干預家庭中雌性之間的沖突等。2015年6月9日該川金絲猴出現咳嗽，16日服用乙酰螺旋素片2片，治療無效，25日因肺炎死亡。隨后對其進行剖檢，采集4個部位的腸內容物利用高通量測序技術進行腸道菌群分析[2-4]。

1 材料與方法

1.1樣品采集

川金絲猴死后，立即剖檢，采集十二指腸段、小腸(包括空腸和回腸)段、盲腸段及大腸(包括結腸和直腸)段共4份樣品進行-80℃保存。

1.2腸道菌群基因組DNA的提取

使用E.Z.N.A.@Stool DNA Kit(Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.)，均按試劑盒要求操作。提取DNA，用紫外分光光度計測定其A260值，計算其濃度，通過A260/A280值鑒定純度，進行0.8%的瓊脂電泳驗證其完整性。

1.3 16S rRNA的PCR擴增和Illumina MiSeq測序

以樣品中菌群總DNA 為模板，用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACCAGGGTATCTAAT-3′)，對細菌16S rRNA 的V3 ～ V4 區域進行PCR擴增。PCR采用20 μL 反應體系，包括0.4 μL FastPfu DNA Polymerase(購買于北京全式金生物技術有限公司)，濃度為5U/μL，4 μL 5×FastPfu Buffer，引物濃度均為5 μmol / L，各0.4 μL，2.5 mmol/LdNTP 2 μL，總DNA 10 ng，補ddH2O 至20 μL。

PCR 過程在ABI Gene Amp 9700 上進行，反應條件為：95 ℃ 預變性3 min；隨后變性循環27次(95 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，45 s 為1 個循環)；72 ℃ 延伸10 min，10 ℃ 冷卻。PCR 產物用含溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并用PCR純化試劑盒Qiagen純化和回收，回收的PCR產物用QuantiFlourTM-ST fluorometer定量，并按測序要求進行混合。然后送至上海美吉生物醫藥科技有限公司。

1.4 ITS rRNA的PCR擴增和Illumina MiSeq測序

以樣品中菌群總DNA為模板，用真菌通用引物1737F(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)和2043R(5′-GCTGCGTTCATCGATGC-3′)，針對真菌ITS區域進行PCR擴增。PCR采用反應體系同上。PCR 過程在ABI Gene Amp 9700 上進行，反應條件為：95 ℃ 預變性3 min；隨后變性循環32 次(95 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，45 s 為1 個循環)；72 ℃ 延伸10 min，10 ℃ 冷卻。其他同上。

1.5數據分析

首先對原始數據進行過濾處理，得到優化序列。然后在去除嵌合體序列后進行OTU聚類分析，對OTU的代表序列作分類學分析。基于OTU聚類分析結果，對OTU進行多種多樣性指數分析，以及對測序深度的檢測；基于分類學信息，在各個分類水平上進行群落結構的統計分析。

2 結果

2.1樣品信息

將采集的十二指腸段、小腸段、盲腸段及大腸段4份腸內容物，分別命名為SJ1、SJ2、SJ3和SJ4。提取微生物DNA，進行測序和分析。

2.2樣品測序深度

用Illumina MiSeq平臺對細菌16S rRNA的V3～V4區進行測序，共獲得184 412條有效序列(cleandata)，平均每個樣品含有(46 103)條序列，每條序列的平均長度是439 bp。基于相似度大于97%的原則，將獲得的有效序列進行OTU聚類，共獲得240個OTU，其中SJ1含181個、SJ2含208個、SJ3含220個和SJ4含213個。根據樣品的稀釋曲線(圖1)，在本試驗的測序深度下，全部樣品的稀疏曲線均趨于平緩，獲得的OTU數量變化不大，說明本試驗的測序量可以覆蓋各樣品的大多數微生物，測序數據量合理。

用Illumina MiSeq平臺對真菌的ITS片段進行測序，共獲得103 316條有效序列，平均每個樣品含有(25 829)條序列，每條序列的平均長度是241 bp。基于相似度大于97%的原則，將獲得的有效序列進行OTU聚類，共獲得341個OTU，其中SJ1含150個、SJ2含166個、SJ3含129個和SJ4含104個。根據樣品的稀釋曲線(圖2)，在本試驗的測序深度下，全部樣品的稀疏曲線均趨于平緩，獲得的OTU數量變化不大，說明本試驗的測序量可以覆蓋各樣品的大多數微生物，測序數據量合理。

2.3 α多樣性分析

應用軟件mothur version v.1.30.1進行ace、chao、coverage、shannon、simpson 5種常用指數的測定(表1)，4份樣品的序列覆蓋率coverage均達到99%以上。根據反應菌群多樣性的指數Simpson和Shannon和菌群豐度指數Chao和Ace可以看出，細菌豐度最高的是盲腸段，細菌多樣性最高的是大腸段，其中十二指腸是細菌多樣性較高但細菌豐度較低。

表1 4份樣品16S rRNA基因庫多樣性指數和覆蓋率

Tab.1 Phylotype coverage and diversity estimation of the 16S rRNA gene of four samples

應用軟件mothur version v.1.30.1進行ace、chao、coverage、shannon、simpson 5種常用指數的測定(表2)，4份樣品的序列覆蓋率均達到99%以上。根據反應菌群多樣性的指數Simpson和Shannon和菌群豐度指數Chao和Ace可以看出，真菌豐度最高的是小腸段，真菌多樣性最高的是大腸段，其中大腸段是真菌多樣性較低同時真菌豐度也較低的腸段。

2.4 菌群分類組成

2.4.1 門分類水平上細菌分類組成

從門的水平上看，金絲猴腸道內的細菌主要分屬于7個門類，包括厚壁菌門(Firmicutes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、變形菌門(Proteobacteria)、梭桿菌門(Fusobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、互養菌門(Synergistetes)及其他。其中占有優勢的是厚壁菌門、疣微菌門和變形菌門。十二指腸中厚壁菌門占比可高達69%，其他門類細菌豐度很低。從十二指腸到最后的直腸，厚壁菌門所占比例逐漸降低，疣微菌門、變形菌門及梭桿菌門所占比例逐漸升高。

表2 4份樣品ITS基因庫多樣性指數和覆蓋率

Tab.2 Phylotype coverage and diversity estimation of the ITS gene of four samples

圖1 4份樣品的稀釋性曲線Fig.1 Rarefaction curve of four samples

圖2 4份樣品的稀釋性曲線Fig.2 Rarefaction curve of four samples

圖3 各腸段內容物在屬水平上的細菌分布Fig.3 Bacterial distribution of the intestinal bacteria at the level of genus

圖4 各腸段內容物在屬水平上的真菌分布Fig.4 Bacterial distribution of the intestinal fungus at the level of genus

2.4.2 屬分類水平上細菌分類組成

從屬的水平上看，金絲猴腸道內的細菌主要分屬于31個屬(圖3)，其中Akkermansia、瘤胃菌科未培養菌屬(Ruminococcaceae_uncultured)、大腸-志賀氏菌屬(Escherichia_Shigella)、韋榮氏菌科未分類菌屬(Veillonellaceae_unclassified)以及毛螺旋菌屬(Lachnospiraceae_unclassified)是主要的屬。其中厚壁菌門的瘤胃菌科(Ruminococcaceae)是十二指腸中最主要的細菌。

2.4.3 門分類水平上真菌分類組成

從門的水平上看，金絲猴腸道內的真菌主要分屬于4類，子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、接合菌門(Zygomycota)以及未分類真菌(Fungi-unclassified)。從所占比例上看，子囊菌門具有絕對的優勢地位，是金絲猴腸道內真菌的最主要的門類。從變化趨勢上看，從十二指腸到直腸，接合菌門和未分類真菌所占比例逐漸升高，而子囊菌門和擔子菌門所占比例略微降低。子囊菌門真菌在腸道內比例可達67%～74%，是最主要的真菌。

2.4.4 屬分類水平上真菌分類組成

從屬的水平上看，金絲猴腸道內的真菌主要分屬于28個屬(圖4)。從十二指腸到大腸，最主要的4個屬未分類Montagnulaceae、松蘿屬(Usnea)、鬼筆屬(Phallus)、槽枝屬(Sulcaria)所占比例逐漸變大，從31%升至82%，而其他24個屬的真菌所占比例逐漸降低，從54%降至8%。

3 討論

湖北神農架國家級自然保護區的大龍潭保護站多年來一直對川金絲猴進行人工投食。以往對投食群的研究主要集中于行為學觀察、社群行為等方面[5-6]。對腸道內的菌群的研究，傳統方法較多[7]，通過高通量測序的方法進行研究較少[8]。本次死亡的投食群的川金絲猴屬于老年半野生金絲猴，為我們研究提供了難得的材料。其從開始出現咳嗽現象到最后死亡大概經歷半月左右時間。期間食欲逐步下降，藥物治療是在16日投喂了2片乙酰螺旋素片。本研究中川金絲猴腸道內菌群多樣性特征代表了老年死亡金絲猴腸道特點。另外，不可忽略的是乙酰螺旋素會對腸道菌群多樣性有一定的影響。乙酰螺旋素是大環內酯類抗生素，對金黃色葡萄球菌、鏈球菌、肺炎球菌以及腦膜炎球菌等有抑菌作用，這將降低陽性球菌所占比例。

根據本次研究川金絲猴腸道內菌群多樣性有如下幾個特點：(1)十二指腸中厚壁菌門細菌占比可高達69%，其他門類細菌豐度很低。厚壁菌門[9]通常是人類和靈長類動物腸道內的主要細菌，但是能達到70%左右的還是非常少見。可能因為十二指腸離胃較近，pH較低，不太適宜其他門類細菌的存在。(2)該金絲猴腸道內細菌組成的另一個特點是疣微菌門在整個腸道內所占比例較高，僅次于厚壁菌門，位居第二，比例在4%～35%之間。金絲猴和人同屬于靈長類，食性都是雜食，腸道菌群結構具有一定相似性。人類的腸道細菌主要是屬于厚壁菌門和擬桿菌門，疣微菌門所占比例甚小。疣微菌門是一門被劃出不久的門類，包括的細菌種類不是很多，具有胞質突出形成的兩個到多個突起，因此得名，在人類糞便中常被發現。疣微菌門的Akkermansia在川金絲猴的腸道比在人類腸道內占有豐度要高。(3)子囊菌門[10]是該只金絲猴腸道內真菌的最主要的門類，具有絕對的比例優勢。從變化趨勢上看，從十二指腸到直腸，接合菌門和未分類真菌所占比例逐漸升高，而子囊菌門和擔子菌門所占比例略微降低。子囊菌門真菌在腸道內比例可達67%～74%，是最主要的真菌。以往對金絲猴腸道內真菌分布情況研究較少，本研究為老年金絲猴腸道內真菌多樣性提供參考。

腸道菌群對動物健康有著重要影響和作用，近年來研究結果很多。人的優勢菌門為厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門[11]；大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)腸道優勢菌門為厚壁菌門、變形菌門、梭桿菌門[12]；老虎腸菌優勢菌門為厚壁菌門、梭桿菌門、擬桿菌門[13]。已有研究顯示健康成年川金絲猴糞樣菌群以厚壁菌門和擬桿菌門為主[14]。另外，不同年齡段多樣性也不同，變化趨勢是隨著年齡的增大，多樣性也變高[7]。不同年齡階段的金絲猴腸道菌群在種屬上的類別上差別不大，不同主要體現在比例上。本次研究的川金絲猴與以往測定的腸道菌群多樣性有一定差異，可能是由于健康狀況不同、年齡不同、個體不同以及用過1次乙酰螺旋素片有關系。

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Golden snub-nosed monkey； Intestinal flora； Diversity analysis； Provisioned group； Shennongjia

對神農架保護區大龍潭保護站1只半野生病死川金絲猴的不同部位的腸道內容物進行了微生物多樣性研究。在無菌條件下取十二指腸段、小腸段、盲腸段及大腸段4個部位的腸內容物，提取微生物基因組DNA，應用高通量測序技術，對細菌和真菌多樣性進行了詳細的分析，比較了不同部位腸道的細菌和真菌的豐度、分布、多樣性及變化趨勢等。發現該川金絲猴腸道細菌主要分屬于厚壁菌門(Firmicutes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、變形菌門(Proteobacteria)、梭桿菌門(Fusobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和Synergistetes 7個門，真菌主要分屬于子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、接合菌門(Zygomycota)以及未分類真菌(Fungi_unclassified)。細菌豐度最高的是盲腸段，細菌多樣性最高的是大腸段，真菌豐度最高的是小腸段，真菌多樣性最高的是大腸段。

Gut Microbiota of a Dead Semi-Wild Golden Snub-Nosed Monkey in a Shennongjia Nature Reserve

Liu Yan1，2Zheng Changming1，2Li Linhai3Zhang Chenglin1，2*Liu Xuefeng1，2Yao Hui4Yu Huiliang4Li Ying1，2Yang Minghai1，2Jia Ting1，2Lu Yan1，2Xia Maohua1，2

(1.Beijing zoo，Beijing，100044，China；2.Beijing Key Laboratory of Captive Related Technologies in Wildlife，Beijing，100044，China；3.Planning and Design Academy of Forest Products Industry，Beijing，100010，China；4.Hubei Golden Monkey Research Center，Shennongjia，442421，China)

We analyzed the gut microbiota from different parts of the intestine of a dead semi-wild golden snub-nosed monkey in Dalongtan Station of Shennongjia National Nature Reserve.Intestinal content was sampled from the duodenum，small intestine(jejunum and ileum)，cecum，and large intestine(colon and rectum)under aseptic condition.Microbial genome DNA were extracted and sequenced by high-output sequencing.Then we analyzed the intestinal bacterial and fungal diversity and compared bacterial and fungal abundance，distribution，diversity and change trends between different parts of the intestinal.The intestinal bacteria of the golden snub-nosed monkey mainly belong to Firmicutes，Verrucomicrobia，Proteobacteria，Fusobacteria，Actinobacteria，Bacteroidetes，and Synergistetes.The intestinal fungi mainly belong to Ascomycota，Basidiomycota，Zygomycota，and unclassified fungi.Bacteria abundance was highest in the cecum while bacterial diversity was highest in the large intestine.Fungi were most abundant in the small intestine while fungus diversity was highest in the large intestine.

北京市公園管理中心科研項目：高通量測序技術分析北京動物園大熊貓腸道菌群多樣性，項目編號：zx2015013；國家科技支撐計劃課題(2013BAD03B01)

劉燕，女，35歲，碩士，畜牧師；主要從事野生動物致病細菌分離等方面研究。E-mail：liuyanllh@sohu.com

*通訊作者：張成林，E-mail：zhch6465@263.net

2016-09-02

S852.61

A

修回日期：2016-10-25

發表日期：2017-05-10

2310-1490(2017)02-194-06