袋鼠傳染性腹瀉病的病原分離與鑒定

張 琴

(上海野生動物園，上海，201399)

袋鼠傳染性腹瀉病的病原分離與鑒定

張 琴

(上海野生動物園，上海，201399)

稿件運行過程

袋鼠； 傳染性腹瀉； 大腸桿菌 O9； O79菌株

袋鼠(Macropusspp.)是袋鼠目(Diprotodontia)袋鼠科(Macropodidae)的有袋動物，主要分布于澳大利亞大陸和巴布亞新幾內亞的部分地區。上海野生動物園飼養的主要是東部灰大袋鼠(Macropusgiganteus)和赤大袋鼠(Macropusrufus)兩個種類，種群大小隨著發病次數的增多而下降。開園以來先后發生過5次傳染性腹瀉病，平均發病率達32.7%，死亡率高達72.9%，對袋鼠的生命健康造成極大的威脅，也給上海野生動物園造成極大的損失。為了找到發病的病原，預防此類疾病的再次發生，我們總結了每次流行病學調查結果、臨床診查特征、病理剖檢情況以及實驗室分離鑒定，確診為引起本病的病原為大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)，并對菌體抗原進行鑒定，結果為O9菌株和O79菌株。此病例在國內未見報道，只有徐麟木等報道過袋鼠球蟲和大腸桿菌混合感染的病例[1]，而上海野生動物園發病的病原純為大腸桿菌感染，并且通過制作自家苗免疫后，取得了理想的防治效果。現將診斷的經過報告如下。

1 發病情況

上海野生動物園袋鼠自開園以來發生過5次傳染性腹瀉病的流行(表1)。發病季節主要是在春季(3～4月)和秋季(10～11月)。春季發病有2批，分別在2003年和2010年；秋季發病的有3批，分別在2002年、2009年和2011年。從表中可以看出春季發病都是連著前一年秋季的，且春季發病率(19.4%、22.7%)要比秋季(31.8%、30.4%、68.2%)的低。前后共發病48頭次，死亡35只(15♂20♀)，平均發病率32.7%，致死率達72.9%。發病不分年齡和性別，但分種類。根據日期劃分，前面3次發病和死亡的都是赤大袋鼠(文中簡稱赤大)，死亡共計23只，平均死亡率為80.9%(3次死亡率為85.7%、85.7%、71.4%)。后面2次死亡的全是東部灰大袋鼠(文中簡稱灰大)，共計12只，平均死亡率為60%(2次死亡率都為60%)。此病每次流行時間為7～14 d。

表1 5次發病情況的數據統計

Tab.1 The data statistics on the incidence of the diseases in 5 times

注：發病率=動物發病數/動物存欄數，死亡率=動物死亡/動物發病數

Note：Morbidity=Numbers of disease kangaroo/ Numbers of all kangaroo，Mortality=Numbers of dead kangaroo/ Numbers of disease kangaroo

2 臨床癥狀與治療

赤大袋鼠發病時主要臨床癥狀為食欲廢絕，而后呈水樣便腹瀉，嚴重時呈黑色稀水樣便或血便，且至后期呈脫水狀態，精神萎靡、呆立，糞失禁；體溫在病初輕度升高為37℃左右或正常，正常(35.8±1.2)℃，個別升高至39.9℃，而后溫度變化不大，除了在臨死之前；病程一般在2～5 d死亡，最急性的病例第一天晚食欲與糞便都正常，第二天晨發現死亡；白細胞嚴重降低，發現不食時白細胞都極端偏低，在1 000個/mm3左右，正常為(4 970±1 870)個/mm3，最低的達到500個/mm3。

灰大袋鼠發病時的臨床癥狀和赤大袋鼠基本相同，體溫在病初輕度升高為36.5℃左右，正常(35.3±1.6)℃，個別也升高至39.9℃。灰大袋鼠剛發病時白細胞降低或不變，正常為(6 250±3 210)個/mm3，而后隨著病程的發展，白細胞迅速地降低，最低的達到500個/mm3。有的尿液隱血。

治療原則是以抗菌消炎、止瀉止血，平衡補液支持療法。根據死亡動物培養出的細菌而選擇的高敏抗生素治療，但治療效果極差，致死率較高。

3 剖檢病變

赤大袋鼠剖解的主要病變集中在腹腔。腹膜呈大面積條狀或斑點狀出血(圖1)，腸系膜嚴重出血(圖2)。胃壁菲薄，黏膜充血出血，特別是在胃的近幽門處有大面積的黏膜脫落和出血，病程長的胃壁有多處出血性潰瘍灶(圖3)。十二指腸、空腸和回腸段腸壁菲薄、腸黏膜脫落，腸內充滿暗紅色腸液。結腸靠近直腸段有多處壞死段，壞死部分外觀為暗紅色(圖4)，切開有暗紅色偽膜，腸壁呈縱條狀增厚約1～2 cm，增厚后局部隆起呈紐扣狀。病程長的可達月余，但終以死亡轉歸，腸壁嚴重增生，堵塞腸腔，形成類似香腸樣病變。腸系膜淋巴結嚴重的腫大、出血，呈暗紅色；頜下淋巴結、肩前淋巴結和腹股溝淋巴結腫大、出血、呈暗褐色，淋巴結周圍呈膠凍樣浸潤、水腫、出血。肝臟色澤深暗，有的表面有大量的針尖樣出血點，有的邊緣出血。腎臟質地軟，嚴重的水腫、瘀血，皮質呈暗紅色出血；心肌基本正常，少數有大小不一的出血點。肺有不同程度瘀血。

圖1 腹部大面積斑點狀出血Fig.1 Massive abdominal hemorrhage

圖2 回腸系膜大面積出血Fig.2 Congestion in the mesentery

圖3 胃壁有多處出血性潰瘍灶Fig.3 Multiple hemorrhagic ulcer in the stomach

灰大袋鼠剖解的主要病變和赤大袋鼠基本相同，但灰大袋鼠的一部分病例的肝臟表面散在彌漫性的針尖狀白色結節。

圖4 腸段呈暗紅色壞死段Fig.4 Ileum was dark red and necrosis

4 實驗室檢驗

4.1 細菌分離培養

無菌取肝、脾、腎、心、頜下淋巴結分別進行普通營養瓊脂培養基和血瓊脂培養基培養；無菌取血液在增菌雙相液進行培養；無菌取脾、肝、腸內容物分別接種于厭氧培養基上，進行厭氧單皿法培養。再分別從每個培養皿內長出的菌落取2～3個可疑菌落再分別接種于伊紅美藍培養基、麥康凱培養基、沙門氏菌篩選顯色培養基和大腸桿菌O157篩選顯色培養基。上述各培養皿和培養瓶都37℃培養18～24 h。各種培養基是由上海科瑪嘉微生物技術有限公司生產。

各個臟器培養出的菌落眼觀基本一致。普通培養基上可見圓形、濕潤、隆起、光滑而邊緣整齊的、露珠樣的菌落。血平皿上可見生長為圓形、濕潤、光滑的不溶血的菌落。厭氧培養基上可見針尖樣小菌落。增菌液內培養的血，可見明顯的均勻渾濁，液面管壁有菌環，管底有黏性沉淀。脾、肝在厭氧培養基上可見密集細小的菌落生長，腸內容物在厭氧培養基上也有密集細小的菌落生長，偶有個別的袋鼠同時有大菌落生長，染色為革蘭氏陽性桿菌。伊紅美藍培養基上形成黑色帶金屬光澤的圓形菌落。麥康培養基上形成粉色圓形菌落。沙門氏菌篩選顯色培養基上長有淡藍色的菌落，未見粉紫色菌落，故非為沙門氏菌。在大腸桿菌O157篩選顯色培養基上呈鐵藍色菌落，未見紫紅色菌落，故非為大腸桿菌O157。

每批次發病后所培養的結果高度一致，只是個別個體還有其他細菌混合感染。而且個別急性發病袋鼠的脾和腎培養未見任何菌落生長。

4.2 染色鏡檢

在普通培養基、血培養基和厭氧培養基上挑取可疑菌落2～3個，進行革蘭氏染色，鏡檢結果基本一致。可見兩端略深的、多數散在排列，偶爾有2～3個連在一起的革蘭氏陰性無芽孢的中等大小的直桿菌。

4.3 生化試驗

挑取麥康凱培養基上的可疑菌落再接種于普通培養基，37℃，18～24 h培養后，用白金耳挑取2～3個菌落于0.85%生理鹽水2 mL內，制成McFarland(麥氏比濁法)0.5濁度的菌懸液。再用滅菌滴管接種于生化發酵管內，其中精氨酸及其對照培養基、賴氨酸和鳥氨酸及其對照管培養基，在接種后各加滅菌液狀石蠟0.5 mL。35～37℃培養18～24 h后判定。氧化酶試驗紙條用蒸餾水浸濕后，再用白金環挑取菌落，涂抹于試紙上，根據顏色反應與否判斷。每次生化結果基本一致(表2)。

表2 此菌生化反應結果

Tab.2 Results of biochemical reaction of the bacteria

根據革蘭氏陰性桿菌新編碼鑒定手冊[2]，結果鑒定為大腸埃希氏菌。

4.4 血清學鑒定

4.4.1 “O”抗原的制備

將純培養的被檢菌株分別接種在普通瓊脂培養基和LB(Luria-Bertani)液體培養基中，于37℃恒溫培養24 h后，用0.5%石炭酸生理鹽水2～3 mL洗下普通瓊脂培養物，放在試管中制成懸液，然后與液體培養物一起置于120℃，高壓2 h，以破壞“K”抗原，制備成高壓抗原。將制得的菌體再用無菌生理鹽水洗滌，以8 000 rpm離心10 min，棄去上清液。最后將菌體用0.5%石炭酸生理鹽水稀釋成含菌109個/mL的菌懸液，置4℃的冰箱中保存備用。

4.4.2 “O”因子血清的稀釋

多價血清的配制：將不同大腸埃希氏菌因子血清混合溶解在10 mL 0.5%的石炭酸生理鹽水中，混勻后分裝入1.5 mL指形管中，置于2～8℃冰箱保存備用。

單因子血清的配制：將一種大腸埃希氏菌因子血清溶解在5 mL 0.5%的石炭酸生理鹽水中，混勻后分裝入1.5 mL指形管中，置于2～8℃冰箱保存備用。

4.4.3 菌株“O”抗原的鑒定

分離菌株的血清型鑒定參照參考文獻[3-4]所述方法進行。用接種環挑取一環多價血清后，再挑取一環制備好的抗原于玻板上，將多因子血清與高壓滅活的抗原在玻板上進行混勻后，觀察其凝集反應，半分鐘內能夠出現明顯凝集反應即為“陽性”反應。若為陽性，再選取多因子血清所對應的單因子血清與此抗原進行玻板凝集反應；同時以高壓滅活抗原與0.5%的石炭酸生理鹽水混合物作為對照，觀察有無自凝現象。

4.4.4 鑒定結果

根據玻板凝集反應，最終確定大腸埃希氏菌為O9和O79兩個血清型。

4.5 藥敏試驗

把制成McFarland(麥氏比濁法)0.5濁度的菌懸液，用滅菌棉簽涂抹普通瓊脂，采用紙片擴散法進行藥敏試驗。藥敏結果以抑菌圈直徑(mm)作為判定標準，20以上判定為極敏，15～20判定為高敏，10～14判定為中敏，10以下判定為低敏，0判定為不敏。由于發病5次，每次都有不同藥物藥敏記錄，且結果不統一。所以記錄格式為(幾次高敏幾次中敏幾次低敏幾次不敏/總共做了幾次：簡稱n極n高n中n低n不/N)。

GRNN神經網絡的第一層為徑向基網絡層，||dist||表示這一層的權值函數，它是歐幾里德距離度量函數，用來計算網絡輸入與第一層的權值iIW1,1之間的距離。圖中符號“·*”表示||dist||的輸出值與閥值b1的元素之間的乘積關系，并將結果形成凈輸入n1，傳送到傳遞函數。徑向基網絡層的傳遞函數一般使用用高斯函數Ri(x)=exp(-||x-ci||/2σi2)。σi被稱為光滑因子，σi越大基函數越平緩。

丁胺卡那(1極1高1中2不/5)，慶大(1高3中1不/4)，恩諾沙星(1高1中1不/3)，呋喃妥因(3高1不/4)，頭孢三嗪(1極1高1不/3)，頭孢他啶(1極1高1不/3)，頭孢唑林(2高2不/4)，諾氟沙星(1極3不/4)，頭孢噻肟(1極2不/3)，氧哌嗪青霉素(1高1中1不/3)，氯霉素(1極2不/3)，哌拉西林鈉(1低/1)，頭孢哌酮(1低/1)，阿奇霉素(1低/1)，阿莫西林(1低/1)，妥布霉素(1低/1)，復合磺胺(4不/4)，頭孢呋辛、克林、環丙沙星、氧氟沙星均(2不/2)，青霉素、四環素、紅霉素、鏈霉素、利福平、萬古霉素、奧羅西林、林可、依諾沙星均(1不/1)。

4.6 動物試驗

采用生化試驗鑒定為大腸桿菌的菌落，移接于普通肉湯培養基中，恒溫37℃，18～24 h，進行增菌培養，所得的增菌純培養液作為動物試驗的病原。由于本病例是多次發病的原因，共做過3次小白鼠毒力試驗，3次結果高度一致。2次兔子毒力試驗，結果也是高度一致。

實驗小白鼠購買于上海西普爾-必凱試驗動物有限公司，云南系，24只(體重20 g)，12♂12♀，雌雄各半，分為6組，每組4只。取肉湯增菌純培養液0.3 mL給予A組腹腔注射，B組口服，C組皮下注射，D組腹腔注射空白肉湯0.3 mL，作為對照組。E組小鼠腹腔注射滅菌生理鹽水0.3 mL，作為空白對照。20只小白鼠均隔離飼養72 h，定期觀察，記錄小白鼠發病，死亡情況(表3)。

對A組死亡小鼠剖解，結果為從十二指腸至回腸段腸壁變薄而黃，充滿氣體，剖開腸壁內可見黃綠色液體，其余個別小鼠有肺充血，肝呈暗綠色，腹腔內臟器壁層充血。取死亡小鼠心血、肝、腎進行分離培養，經鑒定，分離菌同原感染菌完全相同。

實驗兔6只購于市場，年齡為1歲，3♂3♀，雌雄各半，分為2組。采購回來飼養3 d后，A組給予腹腔注射肉湯增菌純培養液4 mL，B組給予口服肉湯增菌純培養液4 mL。腹腔注射生理鹽水4 mL，作為對照。每天觀察以及采血記錄(表4)。

表3 大腸埃希氏菌對小白鼠攻毒試驗的結果

Tab.3 The results of escherichia coli poisoning attack test in mice

表4 大腸埃希氏菌對兔攻毒試驗的結果

Tab.4 The results of escherichia coli poisoning attack test in rabbits

4.7 其他病原檢測

4.7.1 寄生蟲的檢測

刮取多段出血腸段的內容物，置于載玻片直接壓片觀察，未見可疑的蟲卵。

4.7.2 其他可能毒素的動物試驗

取出血的回腸段腸內容物，與等量的生理鹽水混合離心后，分別取其上清液5 mL給2只實驗兔口服，觀察3 d，體溫食欲都無異常。同時取其上清液3 mL給2只實驗兔分別肌注，觀察3 d。第二天體溫升高至40.5℃，第三天恢復，期間食欲無異常。

4.7.3 病毒檢測

主要病變臟器經過電鏡掃描未見可疑病毒。

5 討論

5.1 根據流行病學的調查、臨床癥狀、剖檢病變的分析，結合實驗室診斷，上海野生動物園袋鼠傳染性腹瀉的病原為大腸埃希氏菌，并根據其菌體抗原鑒定為O9菌株和O79菌株。

5.2 大腸埃希氏菌，俗稱大腸桿菌，是人和溫和動物腸道內正常菌群的主要成員之一，為條件性致病菌。根據菌體抗原(O)的不同，大腸桿菌分為166型，但致病性的血清型數量是有限的，常引起腹瀉。根據毒力因子與發病機制的不同，與動物疾病有關的病原性大腸桿菌可分為5類，其中EHEC(腸出血性大腸桿菌)中O157最為典型癥狀為出血性腹瀉，嚴重者可并發急性腎病。此次病例雖然排除了O157存在，但出現的臨床癥狀和其非常相似，特別是腸出血和部分腎的病變，尤其接種的實驗小鼠剖解的結果也高度一致。葛樹剛等撰寫的腸出血性大腸桿菌的研究進展中提到EHEC包括O26、O111、O121等10余種血清型，但未見O79菌株是否也屬于EHEC[5]，有待于進一步證實。而O9菌株已被證實屬于ETEC(產腸毒素大腸桿菌)[6]，易引起人和幼畜腹瀉最常見的病原性大腸桿菌。但這次病例感染于袋鼠卻不分年齡，這是個特異之處，也是說明此次細菌的來勢兇猛，以及袋鼠可能比較敏感此大腸桿菌。

5.3 鑒于此次發病情況的調查，赤大袋鼠比灰大袋鼠發病數量多，且按發病的時間可看出，前面3次都是赤大發病，后面2次才是灰大。而后面2次發病時赤大的存欄數相比灰大來說要少得多，也許這是后面2次只是灰大發病的又一重要原因。從表1還可以得出赤大平均死亡率為80.9%，而灰大平均死亡率為60%，明顯赤大的死亡率高于灰大。是否赤大比灰大更易感此大腸桿菌，有待于以后進一步探究。

5.4 此次病例對藥敏結果不統一，且對大多數抗生素不敏感，對暫時敏感的抗生素也很快產生耐藥性，故臨床治療效果很差。此藥敏結果和賀丹丹等對不同動物源大腸桿菌的耐藥性調查結果一致[7]。本病病程短，病情劇烈，一旦發病死亡率高，鑒于多次經驗教訓，在防治上改變過去的單純依賴抗生素的方法，采用從分離到的菌株作為抗原，制備成自家滅活苗免疫袋鼠預防，預防至今未出現新的病例，達到了預期預防的良好效果。

5.5 上海野生動物園的袋鼠是大場地的半開放式飼養，所以對環境的控制比較差，容易引起大規模的疾病發生，因此筆者認為建立完善的消毒制度也是非常重要的，特別是在易發病季節每年的春季和秋季。每次發病多發生于長時間陰雨或者游客量較大以后，應激因素是本病發生的誘因，應減少動物的應激，提高動物的抵抗力可減少和防止本病的發生。

致謝：非常感謝同事徐春忠、吳昆、馮永其、段俊堂、姜傳坤、徐靜、王艷君等提供的前后多次發病原始資料和實驗資料；特別感謝揚州大學的陳素娟老師的幫助。

[1] 徐麟木，張建榮，金鈴，等，袋鼠急性腸炎的病因及病理學觀察[J].中國獸醫科技，1997，27(5)：40-41.

[2] 徐迪誠，蔡妙英.革蘭氏陰性桿菌新編碼鑒定手冊[M].哈爾濱：黑龍江科學技術出版社，1994：12.

[3] 王世若，陳宗澤，梁煥春，等.獸醫微生物學及免疫學實驗指導[M].長春：吉林科學技術出版社，1984：192-195.

[4] 朱善元，陸輝，王健，等.禽源大腸桿菌的分離及其毒力因子的檢測[J].微生物學報，2007，47(5)：795-799.

[5] 葛樹剛，劉齊家.腸出血性大腸桿菌的研究進展[J].中國公共衛生，1990，6(4)：179-181.

[6] 陸承平.獸醫微生物學[M].北京：中國農業出版社，2001：215-223.

[7] 賀丹丹，黃良宗，陳孝杰，等.不同動物源大腸桿菌的耐藥性調查[J].中國畜牧獸醫，2013，40(10)：211-215.

Kangaroo； Infectious diarrhea；Escherichiacoli； O9 strain and O79 strain

袋鼠(Macropus)傳染性腹瀉病在上海野生動物園先后發生過5次，平均發病率為32.7%，致死率為72.9%，造成了巨大損失。通過總結每次發病的流行病學調查結果、臨床診查特征、病理剖檢情況、實驗室分離鑒定以及動物實驗結果，確診引起本病的病原為大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)，并根據菌體O抗原鑒定為O9菌株和O79菌株。由于此大腸桿菌對許多抗菌藥不敏感，或對暫時敏感的抗生素也很快產生耐藥性，導致治療效果極差。因此通過此次病原的分離確診，得以用制作自家苗的免疫方法，預防了袋鼠傳染性腹瀉病的再次發生。

Isolation and Identification of the Infectious Diarrhea Disease Pathogen in Kangaroo

Zhang Qin

(Shanghai Wild Animal Park，Shanghai，201399，China)

There have been five outbreaks of infectious diarrhea among Kangaroo at Shanghai Wild Animal Park and these caused enormous losses.The morbidity and mortality due to diarrhea were 32.7% and 72.9%，respectively.By summarizing the epidemiological survey，clinical symptoms，pathological alteration，laboratory examination and animal experiment of each outbreak，we confirmed that the diarrhea was caused by pathogenicEscherichiacolithat we identified as the O9 strain and O79 strain according to the bacteria O antigen test.The treatment effect was very poor because thisE.colistrain is resistant to many antibiotics，or temporarily sensitive to some antibiotics but soon resistant.We formulated our own vaccine by isolation of the pathogeny to protect kangaroos from infectious diarrhea.

張琴，女，42歲，學士，中級獸醫師；主要從事野生動物臨床診斷和治療研究。E-mail：zhangqin555333@qq.com

2016-09-28

S858.9

A

修回日期：2016-11-10

發表日期：2017-05-10

2310-1490(2017)02-300-06