銀杏葉提取物對腸炎小鼠免疫機制的調節作用

趙紅偉，張 建，和麗麗，李月芹，朱葉珊，劉建平

(1.河北省人民醫院消化一科，河北 石家莊 050051； 2.河北省人民醫院老年病科，河北 石家莊 050051；3.河北省唐山市中醫院脾胃科，河北 唐山 063000；4. 河北省中醫院脾胃科，河北 石家莊 050011)

·論著·

銀杏葉提取物對腸炎小鼠免疫機制的調節作用

趙紅偉1，張 建1，和麗麗2，李月芹1，朱葉珊3，劉建平4*

(1.河北省人民醫院消化一科，河北 石家莊 050051； 2.河北省人民醫院老年病科，河北 石家莊 050051；3.河北省唐山市中醫院脾胃科，河北 唐山 063000；4. 河北省中醫院脾胃科，河北 石家莊 050011)

目的探討銀杏葉提取物(extract of ginkgo biloba,EGB 761)對腸炎模型小鼠免疫機制調節作用。方法將30只小鼠隨機分為正常組、模型組、EGB 761組，建立動物模型；觀察小鼠疾病活動指數(disease activity index,DAI)、結腸大體評分、結腸病理學變化、流式細胞術檢測T淋巴細胞亞群(CD3+、CD4+、CD8+)變化、免疫比濁法檢測血清免疫球蛋白(IgA、IgG、IgM)變化、免疫組織化學染色測定結腸組織細胞間黏附分子1(intercellular cell adhesion molecule 1，ICAM-1)變化。結果EGB 761干預后小鼠DAI下降明顯，結腸黏膜炎癥程度較模型組明顯減輕；同時能明顯降低模型小鼠血清中CD3+、CD4+含量，升高CD8+含量，降低IgA、IgG、IgM含量，減少結腸組織黏膜中ICAM-1陽性細胞染色。結論EGB 761對腸炎模型小鼠具有免疫調節作用。

結腸炎，潰瘍性；免疫機制；小鼠

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis, UC)是一種原因不明的腸道炎癥性疾病，目前的流行病學資料顯示，其發病率在國內外有逐年上升的趨勢，UC反復發作，嚴重影響患者的正常工作和生活[1-2]。研究表明UC的發病機制與免疫異常關系密切，故針對免疫機制進行調節，可為UC的治療提供新的方向。銀杏葉提取物(extract of ginkgo biloba，EGB 761)的活性成分是萜烯部分，其中包括白果內酯及銀杏內酯，對免疫功能有較大的調節作用。本研究通過對急性期UC模型小鼠的EGB 761干預，探討EGB 761在UC免疫機制方面的調節作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與動物 右旋葡聚糖硫酸鈉(美國Sigma公司；EGB 761(金鈉多注射液,德國威瑪舒培藥廠)；免疫球蛋白IgA、IgG、IgM (四川邁克科技有限責任公司)；細胞間黏附分子1(intercellular cell adhesion molecule 1，ICAM-1)(北京博奧森生物技術有限公司)；CD3+、CD4+、CD8+抗體(美國Beckmen Coulter公司)；磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)；C57BL/6小鼠(體質量19～21 g，年齡8～11周)，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.2 動物模型建立及干預方法 按隨機數字表隨機將30只雄性C57BL/6小鼠分為正常組(10只)、模型組(10只)和EGB 761組(10只)。正常組小鼠從實驗第1天開始自由飲用蒸餾水至第7天，同時給予PBS 1 mL(200 mg/kg)灌腸從第1～7天。模型組小鼠從第1天起自由飲用2% DSS 至第7天，同時給予PBS 1 mL(200 mg/kg)灌腸從第1～7天。EGB 761組小鼠自實驗開始第1天起自由飲用2% DSS至第7天，同時給予銀杏葉提取物1 mL(200 mg/kg)灌腸從第1～7天。第8天處死所有動物[3]。

1.3 小鼠一般情況和疾病活動指數(disease activity index，DAI)以及結腸組織大體評分 每天觀察小鼠的精神狀態、毛發光澤度、食欲、體質量、糞便性狀和有無潛血等。DAI評分標準、臨床表現和病理大體評分標準見表1。

1.4 標本制作 在實驗結束時處死小鼠，蠟包埋的結腸組織分別進行5 μm連續切片，按以下步驟進行染色：二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，自來水沖洗1 min，蘇木精染色7 min，自來水沖洗2 min，1%鹽酸酒精2 s，自來水沖洗2 min，1%氨水30 s，自來水沖洗4 min，0.5%伊紅酒精30 s，酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察腸組織的組織病理學改變。

表1 DAI評分標準、臨床表現和結腸組織大體評分

注：DAI評分=(體質量下降分數+糞便性狀分數+便血分數)/3

1.5 檢測T細胞亞群及免疫球蛋白變化 經腹腔麻醉小鼠，在動物解剖臺上固定，剖開腹部，各組小鼠腹主動脈取血用乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA抗凝)后，取專用試管3支，分別加入CD3 FITC/CD4 PE、CD3 FITC/CD8 PE及其同型對照各10 μL，立刻加抗凝血100 μL，充分混勻后，室溫下避光放置30 min。每管加紅細胞裂解液2～3 mL，充分混勻，避光放置，至液體透亮。1 000 r/min離心5 min，去上清液。上機檢測，流式細胞儀計數。檢測前常規對流式細胞儀進行質量監控和雙色熒光補償，使其均在允許范圍內。免疫比濁法檢測血清免疫球蛋白IgA、IgG、IgM人血清或血漿中免疫球蛋白IgG、IgA和IgM與其相應抗體(羊抗人免疫球蛋白IgG、IgA和IgM血清)在液相中相遇，立即形成抗原-抗體復合物，并形成一定濁度。與通過同樣處理的校準血清比較，即可計算出樣品中免疫球蛋白IgG、IgA和IgM含量。

1.6 結腸組織免疫組織化學染色 新鮮腸組織以5 μm的厚度進行連續冰凍切片，按以下步驟進行一抗ICAM-1的免疫組織化學染色：4%多聚甲醛固定10 min，免疫染色洗滌液洗5 min 3次，封閉液封閉，4 ℃過夜免疫染色洗滌液洗5 min 3次，二抗37 ℃孵育30 min，洗滌液洗5 min 3次，光鏡下觀察結腸組織ICAM-1蛋白的表達情況，陰性對照組用PBS替代一抗，其余步驟同上。

1.7 統計學方法 應用SPSS 13.0軟件進行統計分析，計量資料數比較分別采用單因素方差分析和SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 3組DAI評分比較 與正常組比較，模型組從第4天開始DAI評分逐漸升高，EGB 761組在第4天DAI評分已經下降為0，第5～8天DAI評分也較模型組明顯降低，但仍高于正常組，差異有統計學意義(P<0.01)，見表2。

表2 3組DAI評分比較 分)

*P<0.01與正常組比較 #P<0.01與模型組比較(SNK-q檢驗)

2.2 3組結腸大體評分比較 與正常組比較，模型組結腸大體評分明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01)；EGB761組結腸組織大體評分低于模型組，但仍高于對照組，差異有統計學有意義(P<0.01)。見表3。

2.3 3組結腸組織病理學表現比較 與正常組比較，模型組小鼠結腸黏膜缺損，炎癥細胞廣泛浸潤，隱窩增生；而EGB 761組結腸病理炎癥浸潤、病變深度、隱窩破壞均與模型組比較有不同程度的減輕。見圖1。

2.4 EGB 761對小鼠T細胞亞群變化的影響 與正常組比較，模型組明顯升高血中CD3+、CD4+含量，降低CD8+含量，差異均有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，EGB 761組明顯降低血中CD3+、CD4+含量，升高CD8+含量，差異均有統計學意義(P<0.01)。見表4。

表3 3組結腸組織大體評分比較 分)

*P<0.01與正常組比較 #P<0.01與模型組比較(SNK-q檢驗)

組別 CD3+(%)CD4+(%)CD8+(%)CD4+/CD8+EGB761組49.48±3.35#27.24±3.40#24.80±4.29#1.01±0.25#模型組 64.98±3.55*43.03±3.27*15.34±3.55*2.80±0.22*正常組 43.98±3.3822.18±3.4226.65±4.800.86±0.19F 6873.4007232.3114086.6255145.556P 0.0000.0000.0000.000

*P<0.01 與正常組比較 #P<0.01與模型組比較(SNK-q檢驗)

2.5 3組免疫球蛋白水平比較 與正常組比較，模型組明顯升高血中IgA、IgG、IgM含量，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，EGB 761組明顯降低血中IgA、IgG、IgM含量(P<0.01)，差異有統計學意義(P<0.01)。見表5。

組別 IgAIgGIgMEGB761組0.03±0.02#0.21±0.08#0.22±0.06#模型組 0.08±0.02*0.31±0.08*0.30±0.07*正常組 0.03±0.020.20±0.080.19±0.07F 1626.1686392.0164892.789P 0.0000.0000.000

*P<0.01與正常組比較 #P<0.01與模型組比較(SNK-q檢驗)

2.6 EGB 761對小鼠結腸組織ICAM-1蛋白表達水平的影響 與正常組比較，模型組結腸組織ICAM-1陽性細胞染色面積明顯增多；而EGB 761組ICAM-1陽性細胞蛋白染色面積較模型組明顯減弱。見圖2。

3 討 論

UC是一種高復發的慢性腸道炎癥性疾病，是炎癥性腸病的主要臨床形式之一，但由于本病病程長、病變范圍廣被認為是結腸癌的癌前病變，目前公認本病是一種自身免疫性疾病。研究表明，體內免疫機制的異常誘導了UC的發生[4-5]；免疫反應的異常將進一步導致炎癥細胞和炎癥介質異常，T淋巴細胞(CD3+、CD4+、CD8+)是免疫反應中抗原遞呈的核心環節，從而造成腸道黏膜組織的損傷。在正常情況下ICAM-1很少表達，當多種因素作用下使體內免疫系統被激活時，才會在各種炎癥細胞上表達；腸道黏膜免疫反應的調節有賴于免疫細胞及免疫球蛋白(IgA、IgG、IgM)的參與[6-10]。因此，尋求更為有效的、且不良反應小的、不易復發的理想藥物已成為研究的熱點。

銀杏是古老的樹種，銀杏葉的葉子、果實、種子均有較高的藥用價值，它的藥理作用不斷被認識，臨床應用范圍逐步擴大。銀杏葉中含有天然活性黃酮、苦內酯等對人體健康有益的多種成分，EGB 761廣泛用于治療呼吸系統、心腦血管系統等疾病，有調節循環系統、改善血液循環、保護黏膜組織等作用。研究表明，EGB 761可通過調節免疫機制，抑制炎性癥狀，對大鼠實驗性結腸炎具有保護作用[11-14]。

免疫功能紊亂在UC發生發展中起重要作用，尤其是T淋巴細胞是免疫反應中抗原遞呈的核心環節，T淋巴細胞亞群其中的一亞群功能增強，另一亞群功能減弱，引起亞群間比例紊亂[15]。本研究UC模型小鼠的T淋巴細胞亞群存在著紊亂，但經EGB 761干預后，EGB 761組T淋巴細胞亞群的紊亂得以調節，進一步抑制了炎癥細胞和炎癥介質異常，減少了腸黏膜組織損傷。表明EGB 761組中的結腸組織黏膜較模型組明顯改善，充血及水腫明顯減輕。IgG、IgA 參與UC的變態反應,并參與黏膜內局部免疫復合物的形成[16]。本研究結果顯示EGB 761對異常增高的IgA、IgG有明顯的抑制作用，說明該藥治療UC的機制與有效調節異常免疫反應有關。在正常腸黏膜中ICAM-1通常在毛細血管、微靜脈和大血管內皮細胞低水平表達，而UC時ICAM-1在結腸組織中的分布和表達均明顯增加，在機體免疫過程中起重要作用，使人們認識到直接針對ICAM-1的治療可能成為一種新的手段。本研究結果顯示，對UC模型組小鼠結腸組織行免疫組織化學染色可見ICAM-1陽性細胞染色明顯增多，而經EGB 761干預后結腸組織中ICAM-1陽性細胞的染色明顯減弱。表明EGB 761在急性期UC模型小鼠的機體免疫過程中起重要作用，這為臨床治療UC提供了理論依據。(本文圖見封三)

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(本文編輯：許卓文)

2016-06-17；

2016-07-19

河北省中醫藥管理局科研計劃項目(2016180)

趙紅偉(1979-)，女，河北玉田人，河北省人民醫院主治醫師，醫學博士，從事消化科疾病診治研究。

*通訊作者。E-mail:13603396653@163.com

R574.62

B

1007-3205(2017)09-1076-04

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.09.020