冬凌草甲素對胃癌Sgc-7901細胞炎性細胞因子的影響

唐曉華 董文靜 駱豐 陳琳 章浙忠?

·實驗研究·

冬凌草甲素對胃癌Sgc-7901細胞炎性細胞因子的影響

唐曉華 董文靜 駱豐 陳琳 章浙忠?

目的 通過體外無菌培養Sgc-7901細胞，觀察加入冬凌草甲素后，Sgc-7901細胞炎性因子表達的影響，評價冬凌草甲素對Sgc-7901細胞炎性因子的變化差異，探討冬凌草甲素抗腫瘤的機制，為臨床治療胃癌提供新的理論依據。方法 無菌培養Sgc-7901細胞，CCK-8實驗篩選冬凌草甲素作用24h后抑制Sgc-7901細胞增殖的最佳作用濃度；液相芯片分析系統測定冬凌草甲素對Sgc-7901細胞IL-2、IL-4、IL-6、IL-10以及TNF-α炎性因子的影響。結果 CCK-8實驗結果顯示，冬凌草甲素能抑制Sgc-7901細胞增殖，并且呈劑量依賴性，且IC50分別是66.88μm；液相芯片分析系統檢測冬凌草甲素處理前后Sgc-7901細胞IL-2、IL-4、IL-6、IL-10以及TNF-α炎性因子差異表達結果顯示：冬凌草甲素組與空白對照組比較，部分炎性因子表達下調。結論 冬凌草甲素可以抑制Sgc-7901細胞的增殖，下調了Sgc-7901細胞中IL-6等炎性因子的分泌，從而達到抗腫瘤的作用。

冬凌草甲素 Sgc-7901 炎性細胞因子

據國內外腫瘤流行病學調查發現，隨著生存壞境的日益惡化，人類生活飲食等生存方式的改變，惡性腫瘤的發病率和病死率呈明顯上升的趨勢，惡性腫瘤已經成為我國乃至全球性的公共健康問題［1］，嚴重威脅人類的生活質量。冬凌草具有清熱解毒﹑消炎止痛﹑抗腫瘤之功效［2-3］，素有“人間仙草”之美稱。冬凌草甲素（Oridonin，Ori）是從冬凌草中提取的二萜類化合物，是抗腫瘤的主要活性成分，是中藥中的光譜抗生素。研究表明，冬凌草甲素對胃癌﹑胰腺癌等腫瘤細胞有一定的療效［4］，而細胞分泌的白細胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎性細胞因子與胃癌﹑胰腺癌等腫瘤細胞有一定的相關性，當炎性因子比例失調時，可刺激腫瘤細胞惡性生長，血管和淋巴管生成以及腫瘤的浸潤，因此作者認為冬凌草甲素在一定程度上可以引起胃癌細胞炎性因子的改變。目前，傳統的手術治療以及輔助放化療仍是胃癌的主要治療方式，然而手術治療無法徹底根除胃癌細胞，細胞二次復發率高，且放化療有明顯的毒副作用。因此，探索尋求一種新型的治療胃癌的方式以及藥物成為今后重要的研究熱點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人胃癌細胞Sgc-7901購自中國科學院上海細胞研究所。

1.2 主要試劑 冬凌草甲素（HPLC≥98%）（TAUTO BIOTECH）；RPMI 1640培養液（浙江吉諾生物醫藥技術有限公司）；DMEM培養液（浙江吉諾生物醫藥技術有限公司）；0.25%胰蛋白酶（浙江吉諾生物醫藥技術有限公司）；PBS緩沖液［pH（7.2±0.1）］（浙江吉諾生物醫藥技術有限公司）；無支原體胎牛血清（FB）（浙江天杭生物科技有限公司）；二甲基亞砜（DMSO）（美國Sigma公司）；Cell Counting Kit-8（CCK-8試劑盒）（碧云天生物技術研究所）；人細胞因子磁珠面板（美國 EMD Millipore公司）。

1.3 主要儀器 二氧化碳培養箱（美國 Thermo公司，型號HEPA CLASS 100 3111）；低速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司，型號SC-3610）；恒溫水浴箱（上海森信實驗儀器有限公司，型號DK-S24）；高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司，型號5541R）；Luminex 200 液相懸浮芯片系統（美國Luminex 公司，型號LX10009118401）。

1.4 方法 （1）人胃癌細胞Sgc-7901培養：人胃癌細胞Sgc-7901培養于含10%胎牛血清的RPMI-1640，在37℃﹑5% CO2的恒定條件培養箱培養，當細胞匯合度＞80%，緩慢棄去原培養液，加入適量含EDTA的0.25%胰酶溶液，37℃﹑5% CO2培養箱中作用2～3 min，于倒置顯微鏡下觀察，當細胞間隙增大或皺縮成圓形時，立即棄去胰酶，加入2倍體積含10%FBS的完全培養液終止消化，反復輕柔吹打使細胞脫落，1000r/min離心5min收集細胞并棄去上清液，用適量培養液重懸細胞使細胞成為單細胞懸液，計數并調整細胞濃度接種于新細胞培養瓶中培養。（2）CCK-8法檢測冬凌草甲素抑制BXPC-3/PANC-1﹑Sgc-7901﹑Hct 116細胞增殖實驗：將培養好的Sgc-7901細胞以5.0×104個/ml傳代培養于96孔板中，每孔100μl，于37℃﹑5% CO2培養箱孵育24h左右，待細胞貼壁后，棄去原培養液，按分組分別加入含不同濃度冬凌草甲素的培養液100μl，使其終濃度為0﹑16﹑32﹑64﹑128μm，并設置調零孔，每組5個重復孔，96孔板四周用PBS填充，繼續培養24 h，每孔加10 μl CCK-8溶液，繼續培養4 h后從培養箱中取出，以酶標儀570 nm處測定OD值。（3）液相芯片分析系統檢測冬凌草甲素處理前后對Sgc-7901細胞炎性因子差異表達：將培養好的Sgc-7901細胞接種于24孔板，每孔接種3×104個/2×104個細胞，待細胞融合度達60%左右時，按分組進行處理：對照組更換新的培養液，冬凌草甲素實驗組更換成含66.88μm冬凌草甲素的培養液液，每組設3個重復孔，分別繼續培養12h﹑24h和36h，收集細胞培養液，2000r/min離心10min，取上清，-80℃保存備用。取出試劑盒和樣本，按儀器操作說明操作檢測，最后在滴定板所有孔中加入150μl鞘液，搖床上震蕩5min后，使微球呈懸浮狀態，將板子置入Luminex 200TM，執行軟件后，保存并分析MFI結果，計算樣品中的炎癥細胞因子濃度。

1.5 統計學方法 采用SPSS 17.0統計軟件。計量資料以表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 冬凌草甲素對Sgc-7901細胞增殖活力的影響 由圖1和圖2可知，冬凌草甲素能顯著抑制Sgc-7901細胞增殖，并且呈劑量依賴性，通過SPSS17.0軟件計算可得：作用時間為24h時冬凌草甲素抑制Sgc-7901細胞增殖的IC50為66.88μm。

2.2 冬凌草甲素對Sgc-7901細胞分泌炎性因子表達的影響 通過液相芯片系統檢測冬凌草甲素作用前后人胃癌Sgc-7901細胞IL-2﹑IL-6﹑IL-10﹑TNF-α以及IFN-g等炎性因子差異表達。實驗結果顯示：冬凌草甲素能有效的不同程度下調Sgc-7901細胞IL-6分泌。用66.88μm濃度的冬凌草甲素作用于Sgc-7901細胞12h，24h和36h后，對照組，冬凌草甲素實驗組（12h組﹑24h組﹑36h組）的IL-6分別為（1.93±0.21）pg/ml﹑（1.4±0.1）pg/ml﹑（1.33±0.29）pg/ml﹑（1.23±0.21）pg/ml。與對照組比較，冬凌草甲素實驗組IL-6的表達明顯下降（P＜0.05）。IL-2﹑IL-10﹑TNF-α以及IFN-g等炎性因子差異表達不明顯，差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖1 冬凌草甲素對Sgc-7901細胞OD值的影響

圖2 冬凌草甲素對Sgc-7901細胞抑制率的影響（%）

3 討論

冬凌草，味苦甘，性微寒，具有清熱解毒﹑消炎止痛﹑抗腫瘤之功效［2-3］。冬凌草甲素是從冬凌草中提取的二萜類化合物，為抗腫瘤的主要活性成分。對于冬凌草甲素，有研究報道：冬凌草甲素對胃癌有一定的療效［4］。冬凌草甲素能刺激p21waf1蛋白高表達，擾亂細胞進程而抑制細胞增殖。李娜等［5］發現冬凌草甲素在體外可顯著抑制人卵巢癌細胞株SKOV3的增殖，且誘導其凋亡作用，由此可以初步推測冬凌草甲素可以抑制胃癌細胞的增殖。

胃癌在臨床上是主要常見的惡性消化道腫瘤之一，據中國腫瘤流行病學統計發現，胃癌發病率高居前二位，且發病率呈上升趨勢，給人類的生存和發展帶來了巨大威脅。目前常用的治療方法有藥物治療﹑手術治療﹑放射治療，但這種方式給患者的后期生活質量帶來了無窮的痛苦。因此，尋一種新的治療手段或者探究一種有用的抗消化道腫瘤新藥是目前的重點。

胃癌的發病機制目前仍不明確，其發生﹑發展﹑浸潤以及轉移是一個多方因素相互影響的復雜過程，具有“慢性炎癥”的表現，而炎癥因子在胃癌的生成過程中起到至關重要的作用。通過上述實驗發現，用66.88μm濃度的冬凌草甲素作用于Sgc-7901細胞12h﹑24h和36h后，對照組和冬凌草甲素實驗組（12h組﹑24h組﹑36h組）的IL-6分別為（1.93±0.21）pg/ml﹑（1.4±0.1）pg/ml﹑（1.33±0.29）pg/ml﹑（1.23±0.21）pg/ml。與對照組比較，冬凌草甲素實驗組IL-6的表達明顯下降（P＜0.05）。研究表明：IL-6是一種前炎因子，可以通過體外腫瘤細胞自體分泌，其與IL-1﹑腫瘤壞死因子一起誘導炎癥反應的急性期，啟動免疫應答。大多數學者認為，與IL-6相關的腫瘤血清中IL-6水平增高以及受體表達異常，因此，IL-6及其受體的平衡失調常會影響整個機體的內環境穩定，最終導致機體免疫功能紊亂，誘導腫瘤的發生。液相芯片分析系統檢測，統計后發現，IL-2﹑IL-10﹑TNF-α以及IFN-g等炎性因子差異表達不明顯（P＞0.05），考慮本實驗只針對體外無菌的人胃癌Sgc-7901細胞培養，無機體免疫系統參與，因此難以檢測到IL-2﹑IL-10﹑TNF-α以及IFN-g等炎性因子。研究發現，IL-4和IL-10等抗炎因子通過抑制IL-6等促炎因子的分泌，改變腫瘤的微環境，造成腫瘤細胞的增殖［6］?？寡滓蜃雍痛傺滓蜃酉嗷ヒ种譬p相互作用，當兩者失調時，腫瘤細胞生存的微環境改變，造成腫瘤的發生發展。此外，在一些無胃炎等發病基礎的原發性消化道腫瘤中發現，腫瘤組織中伴有大量炎性細胞的浸潤以及炎性因子表達的上升。因此，在體外培養的Sgc-7901細胞中，雖然L-2﹑IL-10﹑TNF-α以及IFN-g等炎性因子未明確表達。炎癥與腫瘤之間的相關作用機制復雜，作者將通過動物實驗進一步探討冬凌草甲素抗胃癌的作用機制，為中藥抗腫瘤提供了新的思路和新的方向。

［1］ 陳萬青,鄭榮壽,曾紅梅,等．2011年中國惡性腫瘤發病和死亡分析．中國腫瘤,2015,24(1):1-10．

［2］ 劉淑云,譚英姿,范明松,等．冬凌草甲素研究進展．中國當代醫藥,2012,19(13):17-18．

［3］ 高世勇,王瓏．冬凌草的化學和藥理作用研究．哈爾濱商業大學學報(自然科學版),2014,30(1):1-6．

［4］ 劉家云,魏敏,顧琴龍．冬凌草甲素抗腫瘤的研究進展．中國新藥與臨床雜志,2010,29(2):81-84．

［5］ 李娜,金平,張春潔．冬凌草甲素誘導人卵巢癌 SKOV3細胞凋亡及其機制．腫瘤防治研究,2013,40(1):36-41．

［6］ Noguchi S,Hattori M,Sugiyama H,et al．Lactobacillus plantarum NRIC1832 enhances IL-10 production from CD4+T cells in vitro．Biosci Biochem,2012,76(10):1925-1931．

Objective To observe the effect of the expression of infl ammatory cytokines in Sgc-7901 after adding the oridonin and to evaluate oridonin on the changes of infl ammatory cytokines in Sgc-7901 and the effects of oridonin on anti-tumor mechanism through SGC-7901 cells cultured in vitro by sterile，then provide a new theoretical basis for the clinical treatment of gastric cancer. Methods Sgc-7901 cells fostered in sterile culture，through CCK-8 experiment，the optimal concentration to inhibit the proliferation of Sgc-7901 cells were screened to oridonin after 24h. Liquid chip analysis system for determination of oridonin on the effect of IL-2，IL-4，IL-6，IL-10 and TNF-α in Sgc-7901 cells. Results CCK-8 experiment results showed that oridonin could inhibit the proliferation of Sgc-7901 cells in a dose-dependent manner，and the IC50 was 66.88μm. The results of Liquid chip analysis system that to test the differential expression of IL-2，IL-4，IL-6，IL-10 and TNF-α after oridonin treated Sgc-7901 cells before and after showed that partial infl ammatory factors expression down regulated，the oridonin group with the blank control group were compared. Conclusion Oridonin can inhibit the proliferation of Sgc-7901 cells，and reduce the secretion of IL-6 and other infl ammatory factors in Sgc-7901 cells，so as to achieve anti-tumor effect.

Oridonin Sgc-7901 Infl ammatory cytokines

浙江省中醫藥科技計劃項目（2016ZB038）；浙江中醫藥大學校級科研基金項目（2015ZY10）

310000 浙江省中醫院

*通信作者