人乳頭瘤病毒E6/E7mRNA檢測在不典型鱗狀細胞患者中的臨床應用

張月輝 潘嬙微 呂杰強? 鄭園園 童郁

人乳頭瘤病毒E6/E7mRNA檢測在不典型鱗狀細胞患者中的臨床應用

張月輝 潘嬙微 呂杰強? 鄭園園 童郁

目的 探討人乳頭瘤病毒（HPV）E6/E7mRNA檢測在無明確診斷意義的不典型鱗狀細胞（ASC-US）患者中的臨床應用價值。方法 對320例ASC-US患者進行HPV E6/E7mRNA和高危型HPV（HR-HPV）DNA檢測，結合病理學診斷資料進行統計學分析。結果 CINⅡ+級和CINⅢ+級的HPV E6/E7mRNA陽性率分別高于CINⅡ-級和CINⅢ-級，差異均有統計學意義（P＜0.001）；不同等級宮頸病變的HPV E6/ E7mRNA拷貝數不同，差異有統計學意義（P＜0.001），且宮頸病變級別與mRNA拷貝數之間呈正相關。HPV E6/E7mRNA與HR-HPV DNA檢測CINⅡ+級和CINⅢ+級的靈敏度、陽性預測值、陰性預測值差異均無統計學意義（P＞0.05）；兩者特異度比較，差異有統計學意義（P＜0.001）。結論 HPV E6/E7mRNA檢測作為ASC-US的分流指標更確切有效，是目前ASC-US患者是否陰道鏡轉診的較佳分流策略。

E6/E7mRNA 人乳頭瘤病毒 無明確診斷意義的不典型鱗狀細胞

宮頸癌是女性最常見的婦科惡性腫瘤之一，HPV感染是宮頸癌發生的主要危險因素。99.7%的宮頸癌細胞中可以檢測到高危型人乳頭瘤病毒（HR-HPV）［1］。如何及早篩查和預防宮頸癌尤為重要。液基薄層細胞學檢查（TCT）是一種較先進的宮頸細胞學檢查技術，其中無明確診斷意義的不典型鱗狀細胞（ASC-US）是最常見的宮頸細胞學異常結果［2］，同時存在宮頸癌前病變，甚至宮頸癌的可能。如何對ASC-US患者進行分流處理一直是宮頸病變診治中存在的難點和爭論點。本研究對ASC-US患者同時檢測HPV E6/E7mRNA和HR-HPV DNA，并行陰道鏡檢查和宮頸活檢，以探討HPV E6/E7mRNA檢測在ASC-US患者中的臨床應用價值。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選取2013年10月至2015年4月在溫州市人民醫院婦科門診就診，TCT結果為ASC-US的患者320例，年齡21～65歲，中位年齡37歲，均無宮頸上皮內瘤變（CIN）史﹑盆腔放射治療史﹑子宮切除史，排除妊娠，取材前3d內無性生活史。

1.2 方法 （1）TCT檢測：宮頸刷插入宮頸外口旋轉5周，采集宮頸表面及宮頸管內脫落細胞，將細胞洗脫在新柏氏膜式液基液中，用TCT專用制片機制成薄層涂片，經巴氏染色后鏡檢。顯微鏡下觀察分析脫落細胞形態，按照2001年TBS系統標準診斷為ASCUS。將剩余標本置于8℃～25℃保存。（2）HPVE6/ E7mRNA檢測：采用TCT剩余標本，Quantivirus法支鏈DNA雜交捕獲原理定量檢測14種HR-HPV（16﹑18﹑31﹑33﹑35﹑39﹑45﹑51﹑52﹑56﹑58﹑59﹑66和68）E6/E7mRNA的表達，試劑盒購自河南中美合資科蒂亞生物技術有限公司，結果經電腦軟件換算為拷貝數，以拷貝數≥1copy/ml為陽性。（3）HPV DNA檢測：采用DNA導流雜交基因芯片技術，使用HPV分型基因芯片檢測系統（上海凱普生物化學有限公司），檢測21種HPV亞型，其中13種高危亞型（16﹑18﹑31﹑33﹑35﹑39﹑45﹑51﹑52﹑56﹑58﹑59和68），1種HR-HPV陽性即為陽性。（4）陰道鏡檢查及宮頸活檢：由本院陰道鏡?？漆t師對本組患者行陰道鏡檢查，并對可疑病灶進行定位活檢，未見明顯異常者行宮頸3﹑6﹑9﹑12點常規活檢和宮頸管搔刮。根據病理檢查結果分為正常/炎癥﹑CINⅠ級﹑CINⅡ級﹑CINⅢ級﹑宮頸癌。以病理診斷為金標準，以CINⅡ+級（包括CINⅡ級﹑CINⅢ級和宮頸癌）和CINⅢ+級（包括CINⅢ級和宮頸癌）為研究終點，分別以CINⅡ-級（包括正常/炎癥和CINⅠ級）和CINⅢ-級（包括正常/炎癥﹑CINⅠ級和CINⅡ級）為對照組。

1.3 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件。計數資料組間比較采用χ2檢驗；非正態分布以中位數和四分位數間距表示；相關性分析采用Spearman相關分析；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HPV E6/E7mRNA﹑HR-HPV DNA檢測結果與病理診斷比較 由表1可見HPV E6/E7mRNA總陽性率低于HR-HPV DNA的陽性率，差異有統計學意義（P＜0.001）。各組間HPV E6/E7mRNA陽性率比較，差異有統計學意義（P＜0.001）。CINⅡ+級和CINⅢ+級的HPV E6/E7 mRNA陽性率分別高于CINⅡ-級和CINⅢ-級，差異均有統計學意義（P均＜0.001）；HPV E6/E7mRNA和HR-HPV DNA兩種方法對CINⅡ+級檢出率比較差異無統計學意義（P＞0.05）（表1）。

表1 病理診斷及HPV E6/E7mRNA、HR-HPV DNA檢測結果［n（%）］

2.2 不同級別宮頸病變的HPV E6/E7mRNA拷貝數結果 HPV E6/E7mRNA拷貝數呈非正態分布，故用中位數和四分位數間距表示。對各組HPV E6/E7mRNA拷貝數進行分析（見表2），差異有統計學意義（P＜0.001）。將宮頸組織病理結果與HPV E6/E7 mRNA水平進行Spearman等級相關分析，兩者相關系數r=0.523（P＜0.001），提示HPV E6/E7 mRNA水平與組織學病變程度之間存在正相關性。

表2 不同級別宮頸病變的HPV E6/E7mRNA拷貝數比較

2.3 HPV E6/E7mRNA和HR-HPV DNA檢測對CINⅡ+級和CINⅢ+級的診斷價值 兩種方法檢測CINⅡ+級和CINⅢ+級的靈敏度﹑陽性預測值（PPV）﹑陰性預測值（NPV）差異均無統計學意義（P＞0.05）；但兩者特異度比較，差異有統計學意義（P＜0.001）。

3 討論

ASC-US有潛在高級別CIN的風險，甚至是宮頸癌可能，故應十分重視對ASC-US患者的管理。近年將HR-HPV DNA檢測用于ASC-US患者的分流已被普遍用于臨床。但有研究指出＞80%的婦女一生中會感染HPV，而＞90%的感染會在8～24個月內會被自身的免疫系統清除，僅＜10%的HR-HPV會持續感染進一步發展為高級別CIN甚至宮頸癌［3］。因為HPV一旦感染，即可檢測到，故HR-HPV DNA檢測假陽性率高，將其作為ASC-US的分流指標在臨床上存在較多爭議，在歐洲仍未被推薦為首選的宮頸癌篩查方法［4］。研究已證實，HPVE6/E7蛋白持續性高表達是HPV感染導致宮頸發生癌變的必要條件。在HPV病毒整合至宿主細胞后，HPV病毒過度表達E6/E7，同時E6/E7蛋白通過抑制Rb﹑P53等抑癌基因功能﹑干擾細胞周期調控﹑免疫逃逸等機制最終導致細胞發生癌變［5］。HPVE6/ E7mRNA更能準確地反映HPV病毒在宿主細胞內復制轉錄的活動狀態，對于預測宮頸病變惡性轉化和宮頸癌早期篩查具有重要臨床意義。有研究建議采用HPV E6/E7mRNA檢測作為ASC-US的分流指標［6］。

有文獻報道HPVE6/E7mRNA水平與宮頸病變的嚴重程度相關。Ratnam等［7］研究發現隨著宮頸病變的加重，HPVE6/E7mRNA陽性率也隨之增加。張鳳芹等［8］研究發現CIN患者的HPV E6/E7mRNA拷貝值顯著高于無宮頸病變者的HPV E6/E7mRNA拷貝值。本研究發現，CINⅡ+級和CINⅢ+級的HPV E6/E7 mRNA陽性率高于CINⅡ-級和CINⅢ-級組，且不同等級宮頸病變的HPV E6/E7mRNA拷貝數不同，且宮頸病變級別與mRNA拷貝數之間呈正相關。表明在ASC-US患者中，HPV E6/E7mRNA表達水平增加，預示著宮頸病變進展可能性大。而HPV E6/E7 mRNA和HR-HPVDNA檢測相比，對CINⅡ+級的檢出率差異無統計學意義（P＞0.05），在兩種檢測結果均陽性的情況下，HPV E6/E7mRNA拷貝水平在宮頸病變嚴重程度的評估和處理方法的指導上具有更重要的意義。

本研究還發現兩種HPV檢測方法具有相似的靈敏度﹑PPV和NPV，但HPV E6/E7mRNA檢測的特異度明顯提高。Dockter J等［9］以CINⅢ+級作為研究終點，分析與HR-HPV DNA檢測相比，HPV E6/E7mRNA檢測的靈敏度﹑PPV和NPV均相似，但特異度明顯升高。作為新一代的生物標記物，HPV E6/E7mRNA檢測得到的臨床靈敏度和預測值與HR-HPV DNA檢測相似，而在臨床特異度方面，比HR-HPV DNA檢測有了顯著提高。相比HR-HPV DNA檢測，HPV E6/E7mRNA檢測對高級別CIN的診斷價值更高。因此，若將HPVE6/E7mRNA檢測用于ASC-US的分流，可比HR-HPV DNA檢測減少陰道鏡轉診率的同時并不降低靈敏度即高級別宮頸病變的檢出率，可以更精確地選擇高危人群，減少由過度治療造成患者一系列的并發癥，并能減少醫療資源的浪費。

［1］ Tommasino M．The human papillomavirus family and its role in carcinogenesis．Semin Cancer Biol,2014,26(1):13-21．

［2］ Eversole GM,Moriarty AT,Schwartz MR,et al．Practices of participants in the college of American pathologists interlaboratory comparison program in cervicovaginal cytology,2006．Arch Pathol Lab Med,2010,134(3):331-335．

［3］ Kjaer SK, Breugelmans G, Munk C, et al． Population based prevalence, type and age-specific distribution of HPV in women before introduction of an HPV-vaccination program in Denmark．Int J Cancer, 2008,123(8):1864-1870．

［4］ Lie AK,Kristensen G．Human papillomavirus e6/e7 mRNA testing as a predictive marker for cervical cancinoma．Expert Rev Mol Diagn,2008,8(4):405-415．

［5］ McCloskey R,Menges C,Friedman A,et al．Human papillomavirus type 16 E6/E7 upregulation of nucleophosmin is important for proliferation and inhibition of differentiation．J Virol,2010, 84(10): 5131-5139．

［6］ Sorbye SW,Fismen S,Gutteburg J,et al．HPV mRNA is more specific than HPV DNA in triage of women with minor cervical lesions．PLoS One,2014,9(11):e112934．

［7］ Ratnam S,Coutlee F,Fontaine D,et al．Clinical performance of the pretect hpv-proofer E6/E7 mRNA assay in comparison with that of Hybrid Capture 2 test for identification of women at risk of cervical cancer．J Clin Microbi01,2010,48(8):2779-2785．

［8］ 張鳳芹,張清泉,侯素平,等．應用支鏈DNA技術檢測宮頸高危人乳頭瘤病毒E6/E7 mRNA．國際檢驗醫學雜志,2013,34(6):705-706．

［9］ Dockter J,Schroder A,Hill C,et al．Clinical performance of the APTIMA HPV Assay for the detection of high-risk HPV and high-grade cervical lesions．J Clin Virol,2009,45(1):55-61．

Objective To investigate the clinical value of human papillomavirus E6/E7mRNA test in patients with atypical squamous cell of undetermined signifi cance（ASC-US）. Methods Three hundred and twenty patients with ASC-US had HPVE6/E7 mRNA and high-risk（HR）HPV DNA testing.The testing results combined with pathological diagnosis were analyzed. Results The positive rate of HPV E6/E7 mRNA for cervical intraepithelial neoplasia（CIN）II+ and CINIII+ were higher than that of CINII- and CINIII-，and the difference was statistically signifi cant（P＜0.001）.HPV E6/E7mRNA copy number of different grades of cervical lesions was signifi cantly different（P＜0.001）.It was confi rmed that there was positive correlation between the level of cervical lesion and the copies of mRNA.There were no signifi cantly difference（P＞0.05）in sensitivity，positive predictive value，negative predictive value between HPV E6/E7 mRNA test and HR-HPV DNA test for CINII+ and CINIII+，but the specifi city showed statistically signifi cantly difference（P＜0.001）. Conclusion HPVE6/E7mRNA test is more effective in triage of patients with ASC-US，and is currently a better triage test for patients with ASC-US whether or not colposcopy referral.

E6/E7mRNA Human papilloma virus Atypical squamous cell of Undetermined signifi cance

325000 浙江省溫州市人民醫院（張月輝 潘嬙微鄭園園 童郁）

325000 溫州醫科大學附屬第二醫院（呂杰強）

*通信作者