石蠟包埋組織DNA快速提取法應用于分子病理檢測價值評價

楊秀媚

【摘要】 目的 探討分析石蠟包埋組織DNA快速提取法應用于分子病理檢測的價值。方法 63份經石蠟包埋的組織， 隨機分為實驗組（32份）和對照組（31份）。實驗組采用DNA快速提取法， 對照組采用試劑盒DNA提取法。分別對兩組提取出的DNA進行對比分析。結果 實驗組在小組織標本中提取DNA的濃度及純度均低于對照組；實驗組在大組織標本中提取DNA的濃度及純度與對照組比較無顯著差異。對照組中提取的DNA擴增后可達到500 bp以上， 實驗組擴增產物則在400 bp以上。結論 分子病理檢測中應用石蠟包埋組織DNA快速提取法， 可在保證質量的情況下， 大大縮短檢測時間， 提高檢測安全性， 臨床上值得應用。

【關鍵詞】 分子病理檢測；石蠟包埋組織；DNA快速提取法；價值

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.24.118

近年來， 隨著分子病理學的不斷發展， 人們對腫瘤疾病的認識與研究不再局限于患者的器官、細胞， 而是延伸到了蛋白質、DNA等水平。分子病理學使病理診斷變得更加準確、客觀， 而且在腫瘤的治療及預后等方面也有著重要價值， 其中免疫檢測、基因檢測、流式細胞術等技術目前應用較為廣范， 全面推動著醫療技術的發展[1]。提取DNA是分子病理檢測的重要內容， 本研究通過對石蠟包埋組織進行DNA提取、分析， 旨在評價石蠟包埋組織DNA快速提取法應用于分子病理檢測中的價值， 現報告如下。

1 材料與方法

1. 1 材料 選取2016年3～12月經石蠟包埋的組織63份， 將其隨機分為實驗組（32份）和對照組（31份）。所有標本均使用中性甲醛固定， 其中淋巴結、腫瘤、宮頸組織各21份。

1. 2 方法

1. 2. 1 實驗組 采用DNA快速提取法， 對每例標本制作4張蠟片， 首先將蠟片置入離心管中并加入裂解液， 采用金屬浴方法將石蠟溶解， 并將溫度控制在95℃， 持續時間在10 min左右， 然后以14000 r/min對其進行離心操作， 離心過程持續5 min， 最后將蠟層下出現的清涼溶液置于-20℃環境下保存。

1. 2. 2 對照組 采用試劑盒DNA提取法， 與實驗組相同方法制作4張蠟片， 將其置入離心管中并加入二甲苯1 ml， 14000 r/min對其進行離心操作， 3 min后拋除上層清亮液體， 重復操作1次；1 ml無水乙醇加入離心管中， 混勻后重復上述離心操作， 并再次進行乙醇去苯， 完成后開蓋蒸發乙醇；將Buffer ALT及蛋白酶K混入離心管， 混勻后進行消化、孵育；使用離心柱9000 r/min對其進行離心， 2 min后將廢液丟棄；加500 μl緩沖液AW1， 9000 r/min對其進行離心， 2 min后將廢液丟棄；加500 μl緩沖液AW2， 9000 r/min對其進行離心， 2 min后將廢液丟棄；加入ATE靜置2 min， 再離心處理；處理完畢后管內剩余液體置于-20℃環境下保存[2]。

1. 3 DNA產物評價

1. 3. 1 DNA濃度及純度 利用紫外分光光度計評價提取物DNA濃度及其純度。

1. 3. 2 PCR可行性 對提取出的DNA進行PCR擴增（實驗組使用DNA原液， 對照組DNA濃度65 ng/μl）；反應溫度：預變性95℃， 變性95℃， 退火60℃；反應時間：預變性7 min， 變性45 s， 退火45 s；經循環35次后對其進行電泳處理， 并經BIO-RAD系統對兩組DNA質量進行分析。

2 結果

2. 1 提取物DNA濃度及純度評價 實驗組在小組織標本中提取DNA的濃度及純度均低于對照組；實驗組在大組織標本中提取DNA的濃度及純度與對照組比較無顯著差異。

2. 2 PCR可行性對比分析 對照組中提取的DNA擴增后可達到500 bP以上，實驗組中不同組織提取的DNA擴增產物大小不同，其中宮頸組織可達300 bp，其余組織則在400 bp以上。見圖1。

3 討論

隨著科學技術的持續發展及醫療水平的不斷進步， 石蠟包埋組織因其具有便于運輸儲存、交叉污染少等優點， 被廣泛應用于臨床病理工作中[3-6]。在進行分子病理檢測時提取DNA的方法中， 酚-氯仿法應用較早， 但因其操作過程復雜， 且對人體有損害等缺點， 目前已逐漸被離心柱法所代替[3]。離心柱法對操作者要求相對較低， 且得到的DNA質量較高， 但檢測過程中因為需要對組織進行消化， 操作步驟較多， 所以檢測所需時間較長， 且在操作過程中換管頻繁， 增加了標本污染的可能性[4]。如何能夠在保證DNA提取質量的情況下縮短操作時間， 成為了研究的熱點問題之一。

石蠟包埋組織DNA快速提取法無需應用有毒試劑， 如二甲苯、氯仿等， 能夠更好地保障檢測人員的身體健康及生命安全[7-11]；采用離心管， 不但較通常所應用的PCR管方便許多， 而且可有效降低交叉污染的可能性， 從而提高DNA提取質量；將加熱溫度設置為95℃， 可有效避免過高的溫度所造成的試管爆炸， 大大提高操作安全性[12-14]。石蠟包埋組織在處理過程當中， 會經過甲醛固定以及脫水等步驟， 在進行分子病理檢測之前已放置了一定的時間， 所以DNA斷裂情況較為常見。有研究結果表明， DNA快速提取法所得到的DNA完全可用于PCR擴增[5]。為進一步探討分析石蠟包埋組織DNA快速提取法應用于分子病理檢測價值， 本實驗對石蠟包埋組織進行了分組實驗研究。

本實驗研究結果顯示， 實驗組在小組織標本中提取DNA的濃度及純度均低于對照組；實驗組在大組織標本中提取DNA的濃度及純度與對照組比較無顯著差異。對照組中提取的DNA擴增后可達到500 bp以上， 實驗組擴增產物則在400 bp以上。endprint

綜上所述， 使用石蠟包埋組織DNA快速提取法所提取的DNA， 雖然在小組織中DNA濃度及純度相對較低， 但完全可滿足分子病理檢測所需的條件， 而且該方法擁有方便、快速、經濟等優點， 具有顯著的優勢， 可在臨床上推薦與應用。

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[收稿日期：2017-06-02]endprint