葉黃素對人RPE細胞氧化應激損傷的保護作用

楊 敏，張倩玉，黃宏偉，馬 譞，王 嬌，馬 樂

(1 西安交通大學公共衛生學院，西安 710061；2西安交通大學第一附屬醫院，西安 710061)

葉黃素對人RPE細胞氧化應激損傷的保護作用

楊 敏1，張倩玉1，黃宏偉1，馬 譞2，王 嬌2，馬 樂1

(1西安交通大學公共衛生學院，西安 710061；2西安交通大學第一附屬醫院，西安 710061)

目的：外源性給予過氧化氫(H2O2)誘導構建人視網膜色素上皮細胞(Retinal pigment epithelial，RPE)細胞氧化損傷模型，探究H2O2的最佳建模濃度，并探討葉黃素對H2O2誘導人RPE細胞氧化損傷的保護作用。方法：本研究以人RPE細胞為實驗對象。不同濃度H2O2(0、50、100、200、400、600μmol/L)處理RPE細胞1 h后，觀察細胞形態的改變，并測定細胞生存率和細胞內ROS濃度進而確定H2O2的最佳建模濃度。不同劑量葉黃素(1、2.5、5、7.5、10μg/mL)預處理RPE細胞24h，隨后給予100μmol/L H2O2作用1h，測定各組細胞生存率和細胞內活性氧(ROS)濃度，從而評價葉黃素對RPE細胞氧化損傷的作用。結果：H2O2作用后，隨H2O2濃度的增加，RPE細胞生存率逐步下降；細胞內ROS濃度隨H2O2的濃度增加而顯著升高。與損傷對照組相比，各葉黃素處理組RPE細胞生存率顯著升高，同時細胞內ROS濃度顯著下降。結論：H2O2可導致RPE細胞出現氧化應激損傷，細胞ROS含量顯著增加。葉黃素干預后可顯著減緩H2O2誘導的氧化應激反應，提示其可通過提高RPE細胞的生存率、抑制細胞內ROS濃度，保護RPE細胞免受氧化損傷，從而對年齡相關性黃斑變性等眼部退行性疾病起到預防和減緩作用。

過氧化氫；視網膜色素上皮細胞；氧化應激；葉黃素

年齡相關性黃斑變性(Age-related macular degeneration，AMD)是一種常見的神經退行性疾病，是導致西方發達國家中老年人視力喪失和致盲的主要眼底疾病[1]。目前該病的確切病因及發病機制仍不清楚，多數研究認為其是一種與遺傳、環境、基因、代謝障礙等相關的多因素疾病[2]。視網膜色素上皮(Retinal pigment epithelial，RPE)作為眼底的重要組織，其可通過吞噬光感受器外節盤膜、合成分泌多種生長因子等途徑發揮其特定生理功能，從而維持視網膜正常視覺功能[3]。有研究表明，氧化應激可引起RPE細胞功能紊亂及視網膜退行性改變，進而促進AMD的病理發展[4]。累積的活性氧(reactive oxygen species，ROS)引起的氧化應激是造成RPE細胞功能紊亂的重要使動因素[5]。過氧化氫(H2O2)作為主要的活性氧類物質，急性H2O2作用則會導致細胞出現氧化損傷[6]，因而其常作為細胞氧化損傷模型的誘導劑。

葉黃素是一種天然的優良抗氧化劑，在機體內可特異性富集于視網膜黃斑區[7-8]。既往人群葉黃素干預研究結果提示其在維持RPE細胞正常生理功能及保護視網膜免受氧化損傷中扮演重要角色，但其保護機制尚不明確[9-10]。因此，探討葉黃素對RPE細胞氧化損傷作用的保護機制對深入闡明AMD的發病機制具有重大意義[11]。鑒于以上研究背景，本研究外源性給予H2O2建立RPE細胞氧化損傷模型，初步探討葉黃素對視網膜氧化損傷的保護作用，揭示葉黃素對RPE細胞保護功能的作用機理。通過探討H2O2處理與葉黃素干預對RPE細胞的作用機制，為臨床上治療AMD等眼部退行性疾病提供理論依據，為進一步深入開展葉黃素減輕AMD等眼部退行性疾病的分子機制研究奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

葉黃素(美國ChromeDex公司)；人視網膜色素上皮細胞A-RPE 19細胞系(美國標準菌種收集中心，ATCC)；改良型 RPMI-1640 培養液(美國HyClone公司)；胎牛血清(美國Gibco 公司)；青霉素(山東魯抗醫藥股份有限公司)；鏈霉素(哈藥集團制藥總廠)；0.25%胰蛋白酶溶液(美國 Solarbio 公司)；MTT(美國Sigma公司)；ROS試劑盒(南京建成生物工程研究所)；30%H2O2(西安化學試劑廠)；酶聯免疫檢測儀(美國 Bio-rad公司)；CO2培養箱(美國Thermo公司)；倒置相差顯微鏡AE31型(Motic公司)；多功能酶標儀(德國BMG公司)。

1.2 方法

1.2.1 RPE細胞的復蘇與培養 取出液氮中的RPE細胞置于37℃水浴迅速解凍，將細胞懸液移入含培養液的15毫升離心管中，800r/min離心5min，棄去上清，加入1 mL RPMI-1640培養液(含體積分數10%胎牛血清和1%的青霉素鏈霉素混合液)，吹打混勻后將細胞懸液移入25 mL細胞培養瓶，置于37℃、5%CO2、濕度為90%的CO2培養箱中培養，待細胞貼壁后換液繼續培養。細胞生長至對數期，即80%～90%融合狀態時，棄去培養瓶內舊培養液，0.25%胰蛋白酶消化液消化以1：2傳代繼續培養。

1.2.2 試驗分組 H2O2實驗正常對照組RPMI-1640培養液培養1h；H2O2處理組不同濃度的H2O2(50、100、200、400、600μmol/L)培養1h。

葉黃素干預試驗：損傷對照組100μmol/LH2O2培養1h；葉黃素干預組不同濃度的葉黃素(1、2.5、5、7.5、10μg/mL)培養24h后再更換100μmol/L H2O2繼續培養1h。

1.2.3 細胞相對生存活力的測定 RPE細胞以7 000個/孔濃度接種于96孔板，常規培養48h后給予不同濃度梯度H2O2干預作用1h，棄去舊培養液。每孔避光加入20μL 5mg/mL MTT溶液，CO2培養箱培養4h。培養結束后小心棄去上清液，每孔加入150μL二甲基亞砜溶液，微量振蕩器震蕩10min，用多功能酶標儀于492nm波長處測出每孔吸光度OD值。每組設定5個復孔，3次重復實驗，依據式(1)計算各組細胞生存率：

(1)

1.2.4 細胞內ROS水平測定 RPE細胞以2.5×105個/孔接種于6孔板，常規培養48h。每孔避光加入2mL新配的工作濃度為1μmol/L的DCFH-DA探針，37℃培養箱中孵育30min。棄舊培養液，PBS清洗3遍后給予不同濃度梯度H2O2干預作用1h。棄去培養液后以0.25%胰蛋白酶消化液消化制備單細胞懸液，調整細胞密度以7 000個/孔接種于酶標板。以激發波長502nm，發射波長530nm的酶標儀測出每孔熒光強度。每組設定5個復孔，3次重復實驗，依據式(2)計算每孔相對熒光強度。

(2)

1.2.5 統計學分析 數據資料以均數±標準差表示，采用SPSS18.0統計軟件進行統計分析，比較各組間差異。采用單因素方差分析比較各組細胞的相對生存率及細胞內ROS濃度的差異，LSD法進行兩兩組間差異比較。P<0.05可認為具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 不同濃度H2O2處理對RPE細胞生存力和ROS水平的影響

由細胞生存率數據結果可知，隨著H2O2濃度的增大，細胞生存率逐漸下降；不同組細胞生存率具有顯著統計學差異(P<0.01)；50組與對照組及100組組間無統計學差異(P>0.05)；其余組間兩兩比較均有顯著統計學差異(P<0.01)。ROS檢測結果表明H2O2濃度越高，細胞的相對熒光強度比值越大，細胞ROS水平越高。對照組與50μmol/L組兩兩比較無統計學差異(P>0.05)，其余組間兩兩比較均有統計學差異(P<0.05)(圖1～2)。

圖1 不同濃度H2O2處理對RPE細胞生存力的影響

圖2 不同濃度H2O2處理對RPE細胞內ROS水平的影響注：與對照組比較，**P<0.01

2.2 葉黃素對H2O2氧化損傷后RPE細胞生存率的影響

通過比較H2O2氧化損傷對照組和不同濃度葉黃素干預H2O2損傷后RPE細胞的細胞生存率可知，葉黃素濃度越高，則生存率越高。葉黃素濃度為10μg/mL時，細胞生存率較7.5μg/mL處理組下降，但仍高于實驗對照組。組間兩兩比較，7.5μg/mL處理組與10μg/mL處理組細胞生存率無統計學差異，余組間兩兩比較均有統計學差異(P<0.01)(圖3)。

圖3 葉黃素對H2O2損傷后RPE細胞的細胞生存率的影響注：與損傷對照組比較，**P<0.01、*P<0.05

2.3 葉黃素對H2O2誘導氧化損傷后細胞內ROS濃度的影響

不同濃度葉黃素預處理RPE細胞，各組間細胞相對熒光強度無統計學差異(P>0.05)。與損傷對照組相比，葉黃素各處理組較對照組細胞相對熒光強度比值下降，差異有統計學意義(P<0.05)；葉黃素處理組組間兩兩比較無統計學差異(P>0.05)(附表、圖4)。

附表 不同濃度葉黃素預處理RPE細胞的相對熒光強度

圖4 葉黃素對H2O2損傷后RPE細胞內ROS濃度的影響注：與損傷對照組比較，**P<0.01、*P<0.05

3 討論

在自然生理條件下，隨著年齡的增長，人RPE細胞處于慢性、累積性的氧化損傷，逐步引起人RPE細胞正常生理功能紊亂，最終誘導RPE細胞凋亡壞死[12]。既往研究者主要采用藍光照射和H2O2處理兩種模型，實驗證明兩種處理方法都可成功誘導RPE細胞內ROS生成[13-14]。本研究結果顯示，外源性50～600 μmol/L H2O2作用1 h后，可導致體外培養的RPE細胞活力呈現濃度依賴性顯著降低，濃度越高，細胞損傷越重。此外，隨H2O2濃度的增加凋亡程度增加，且與對照組相比ROS濃度明顯增高，提示H2O2可誘導RPE細胞出現氧化損傷，其程度隨H2O2濃度的增加而逐漸加重。為模擬自然條件，本研究采用有統計學差異的最小濃度(100 μmol/L H2O2)處理RPE細胞建立氧化損傷模型。H2O2是一種可在機體內發揮廣泛生物介質效應的重要ROS，極易透過細胞膜，可與細胞內Fe2+通過Fenton反應生成高活性的自由基。短時間內暴露于H2O2環境中則會引起細胞正常代謝功能紊亂，可誘導細胞產生氧化應激和炎癥反應、促進RPE細胞凋亡[15]。研究發現，當機體處于氧化應激狀態時，機體產生的ROS超過其本身清除能力，視網膜上積累的ROS損傷線粒體DNA(mtDNA)，氧化系統與抗氧化平衡系統逐步失衡，引起黃斑中心凹受到氧化應激的損害，最終導致與年齡相關的損傷，加速了AMD的發生、發展[16-17]。

葉黃素是一種存在于視網膜黃斑區的含氧類胡蘿卜素，其自身不能轉化生成維生素A，但在維持人體正常視覺功能中扮演重要角色。其化學結構含有多個不飽和共軛雙鍵且鏈末端為烴基，該結構特點使其具有抗氧化作用，從而發揮獨特而強大的生理功能[8，18]。近期研究發現，葉黃素是視網膜黃斑色素的主要成分，機體攝入葉黃素后可選擇性地富集于視網膜黃斑部位，在維持視網膜正常生理功能及預防視網膜損傷中發揮重要作用[7，19]。本研究結果顯示，葉黃素可顯著提高H2O2氧化損傷后RPE細胞的生存率。葉黃素10 μg/mL組與葉黃素7.5 μg/mL組比較細胞生存率有所下降，但仍顯著高于損傷對照組。猜測高劑量的葉黃素可能具有輕微的細胞毒性，在后續的研究中需進一步的驗證。在對RPE細胞給予H2O2處理前葉黃素干預24 h，結果發現細胞內ROS濃度較損傷對照組明顯下降，但未明顯表現出呈劑量濃度依賴性下降。提示葉黃素可能是通過ROS清除作用進而減輕其對RPE細胞的氧化損傷，從而保護RPE細胞。葉黃素的保護機制可能是其可有效清除機體產生的ROS，淬滅大量的單氧基團和過氧化自由基，從而抑制脂類氧化反應，抵御氧化應激造成的繼發性細胞損傷，進一步保護視網膜[20]。已有流行病學研究證實一定量的葉黃素攝入可使AMD的發病風險下降。AMD患者補充葉黃素，可提高視網膜黃斑色素密度，減緩黃斑的退化速度，從而提高早期AMD患者的視力水平[21-24]。提示適量增加葉黃素的攝入量可預防年齡相關性眼部退行性疾病的發生。

綜上所述，外源性H2O2作用下，RPE細胞內ROS濃度明顯增高，細胞生存率呈呈劑量依賴性下降；葉黃素干預后RPE細胞生存率明顯提高，細胞內ROS濃度亦明顯下降。提示其通過抑制H2O2誘導的氧化應激反應從而減輕H2O2對RPE細胞的損傷作用。葉黃素通過清除ROS過氧化自由基、減少脂質過氧化、抑制炎癥因子表達等途徑保護RPE細胞并抑制AMD等眼部退行性疾病的發生發展。因此膳食提高葉黃素等天然抗氧化物及其他抗氧化劑的攝入量，維持視網膜氧化狀態平衡對AMD等眼部退行性疾病的緩解及治療具有重大意義。◇

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(責任編輯 李婷婷)

Protective Effect of Lutein on Human RPE Cells from Oxidative Stress

YANG Min1，ZHANG Qian-yu1，HUANG Hong-wei1，MA Xuan2，WANG Jiao2，MA Le1
(1School of Public Health，Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710061，China；2The First Affiliated Hospital Medical School of Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710061，China)

H2O2；retinal pigment epithelial cell；oxidative stress；lutein

國家自然科學基金(項目編號：81202198)。

楊敏(1993— )，女，碩士，研究方向：營養流行病學。

馬樂(1983— )，男，博士，碩士生導師，研究方向：營養與慢性病。