HPLC法測定南瓜中β-胡蘿卜素

鄧俊琳，朱永清，劉小俊，楊 宏，梁根云，陳 建，夏 陳，張盈嬌，李 娟

(1四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，成都 610066；2四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所/蔬菜種質(zhì)與品種創(chuàng)新四川省重點實驗室，成都 610066)

HPLC法測定南瓜中β-胡蘿卜素

鄧俊琳1，朱永清1，劉小俊2，楊 宏2，梁根云2，陳 建1，夏 陳1，張盈嬌1，李 娟1

(1四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，成都 610066；2四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所/蔬菜種質(zhì)與品種創(chuàng)新四川省重點實驗室，成都 610066)

目的：建立高效液相色譜法(HPLC)測定南瓜中β-胡蘿卜素含量的方法，并對12份南瓜樣品中β-胡蘿卜素含量進行測定。方法：色譜柱：Eclipse XDB-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流動相：水(A)+丙酮(B)；檢測波長：450nm。結(jié)果：南瓜中β-胡蘿卜素在35 min內(nèi)得到較好分離，重復(fù)性好(RSD=5.11%)，精密度高(RSD=0.70%)，穩(wěn)定性好(RSD=2.73%)，加標回收結(jié)果準確可靠(RSD=2.06%)。12份南瓜樣品中β-胡蘿卜素含量差異較大(8.9～94.4 μg/g)，印度南瓜16296-1中β-胡蘿卜素含量最高，其次為中國南瓜9132、印度南瓜16291-2和16167-8，這3種南瓜中β-胡蘿卜素含量較接近(均≥76 μg/g)，含量最低的為印度南瓜16185-6。結(jié)論：建立了一種快速測定南瓜中β-胡蘿卜素的高效液相色譜方法，該方法準確、可靠；12份南瓜樣品中β-胡蘿卜素含量差異較大。

南瓜；β-胡蘿卜素；HPLC

南瓜耐干旱貧瘠、適應(yīng)能力較強，廣泛栽培于世界各地。據(jù)統(tǒng)計，2013年我國南瓜栽培面積達 38.77 萬hm2，總產(chǎn)量在 710 萬t左右，是世界上最大的南瓜生產(chǎn)國。南瓜營養(yǎng)豐富且全面，富含果膠、纖維素、淀粉、脂肪、甘露醇、維生素、生物堿、β-胡蘿卜素等[1]。研究表明，南瓜具有降血糖、預(yù)防動脈粥樣硬化和冠心病作用、防癌、解毒、保肝腎、抗氧化等諸多功效[2-4]。

自然界中胡蘿卜素主要包括有α、β、γ等異構(gòu)體，其中以β-胡蘿卜素的活性最高。研究表明，補充 β-胡蘿卜素或提高β-胡蘿卜素血濃度，通過抗氧化、增強機體免疫能力以及促進細胞縫隙連接等作用，抑制或降低癌癥的發(fā)生和發(fā)展[5]。β-胡蘿卜素可直接抑制和淬滅由電離輻射產(chǎn)生的活性單線態(tài)氧，維護線粒體膜的完整性，阻止自由基的進一步產(chǎn)生，減輕放射線對人體產(chǎn)生的毒副作用[6]。此外，β-胡蘿卜素還有預(yù)防心血管疾病、增強免疫、補充人體維生素A等諸多功效[7-9]。隨著對其認識的不斷深入，β-胡蘿卜素已被廣泛用于食品、工業(yè)、化妝品、醫(yī)藥等諸多領(lǐng)域。

大多數(shù)南瓜呈現(xiàn)黃色或橙色，與其高含量的類胡蘿卜素有關(guān)，主要是β-胡蘿卜素和α-蘿卜素[10]。β-胡蘿卜素不僅與南瓜色澤有關(guān)，還與一些南瓜生理活性有密切關(guān)聯(lián)。Na-Rae Kim等[11]研究表明，β-胡蘿卜素可能是南瓜改善抑郁的主要活性成分。β-胡蘿卜素是維生素A的前體，南瓜因含有高含量的β-胡蘿卜素而被認為是缺乏維生素A的兒童和婦女們?nèi)粘Ｉ攀车臐撛谘a充源[12]。β-胡蘿卜素作為南瓜的重要功效成分，對其品質(zhì)有直接影響，但到目前為止，南瓜中β-胡蘿卜素的檢測并未見一種檢測前處理簡單、檢測方法準確可靠、檢測效率高的方法。本文建立了一種簡單、快速、準確的HPLC檢測方法，并對該方法進行方法學(xué)考察，以及對12份南瓜樣品中的β-胡蘿卜素含量進行測定，以期為南瓜中β-胡蘿卜素的快速檢測和深入研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南瓜：2017年2月9日采收于四川省農(nóng)科院海南試驗基地。樣品詳細信息見表1。鮮樣去皮和瓤，取果肉切片打漿，稱取1g于研砵中，加丙酮研磨至無色，將研磨液定容至25mL，0.22μm濾膜過濾于液相進樣瓶中待測。各試劑均為色譜純，β-胡蘿卜素標準品購于北京索萊寶科技有限公司(純度≥98%)。

電子天平，奧豪斯儀器(上海)有限公司；1260型高效液相色譜儀，美國Agilent公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Eclipse XDB-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；DAD檢測器，檢測波長450nm；柱溫：25℃；進樣量：20μL；流速：1.5mL/min；流動相：水(A)+丙酮(B)，梯度洗脫：0～30min，75%～95%(B)；30～32min，95%～100%(B)；32～35min，100%(B)。

表1 12份南瓜材料

1.2.2 β-胡蘿卜素標準品溶液的制備 準確稱取β-胡蘿卜素標準品14.5mg，置于25mL容量瓶中，丙酮溶解并定容，得濃度為580μg/mL的標準品母液，對該母液分別稀釋10、20、100、200、1 000、2 000倍，配置不同濃度的標準品溶液。

1.2.3 南瓜樣品溶液的制備 分別精確稱取同一批南瓜樣品3份，每份1g，置于研缽中，加入少量石英砂，丙酮研磨提取至無色，30℃水浴減壓濃縮，丙酮定溶于25mL容量瓶，0.22μm微孔濾膜過濾，作為樣品待測液。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-胡蘿卜素標準品溶液和南瓜樣品的HPLC色譜

由附圖可知，在南瓜樣品色譜圖中的33.215min處有色譜峰，其保留時間與標準品的色譜峰保留時間33.280min基本一致。在此色譜條件下，南瓜樣品中的β-胡蘿卜素得到較好的分離。

附圖 β-胡蘿卜素標準品(a)和南瓜樣品(b)的HPLC色譜

2.2 方法學(xué)驗證

2.2.1 標準曲線和線性關(guān)系 在1.2.1色譜條件下分別對濃度為0.28、0.57、2.87、5.687、28.42、56.83 μg/mL的β-胡蘿卜素標準品進樣20 μL色譜分析。以濃度(X，μg/mL)為橫坐標、峰面積(Y)為縱坐標繪制標準曲線，得β-胡蘿卜素的線性方程為Y=61.866X-8.371 6(R2=0.999 8)，β-胡蘿卜素的峰面積和濃度之間呈良好的線性關(guān)系。

2.2.2 重復(fù)性試驗 按照1.2.3的方法平行制備南瓜樣品溶液5份，以1.2.1的色譜條件進行色譜測定分析，計算β-胡蘿卜素平均提取量為24.55μg/g，其相對標準偏差(RSD)為5.11%，表明試驗方法重復(fù)性良好。

2.2.3 精密度試驗 按照1.2.2的方法制備β-胡蘿卜素標準品溶液1份，以1.2.1的色譜條件連續(xù)進樣5次，計算β-胡蘿卜素峰面積的RSD，為0.70%，表明儀器精密度良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗 按照1.2.3的方法制備南瓜樣品溶液1份，以1.2.1的色譜條件分別在時間為0、2、4、6、8 h進樣，計算β-胡蘿卜素峰面積的RSD，為2.73%，表明試驗穩(wěn)定性良好良好。

2.2.5 回收率試驗 稱取5份南瓜樣品于研砵中，分別加入相同的β-胡蘿卜素標準品，以1.2.3的方法制備樣品，再按1.2.1的色譜條件進行分析。結(jié)果顯示，β-胡蘿卜素的平均加標回收率為93.922 5%，RSD為2.06%(表2)，表明試驗方法有較好的回收率，回收結(jié)果準確可靠。

2.2.6 12份南瓜材料中β-胡蘿卜素的含量 由表2可知，南瓜中β-胡蘿卜素含量差異顯著，不同類型南瓜或者相同類型的南瓜中β-胡蘿卜素含量有較大差異。其中，β-胡蘿卜素含量最高為印度南瓜16296-1，為94.4μg/g，其次為印度南瓜16167-8、16291-2和中國南瓜9132，含量均在75～80μg/g之間；印度南瓜16183-1和中國南瓜9133中含量均為13.9μg/g；β-胡蘿卜素含量最低為印度南瓜16185-6，僅含8.9μg/g。

表2 β-胡蘿卜素的加標回收率(n=6)

表3 南瓜中β-胡蘿卜素含量 單位：μg/g

3 討論

β-胡蘿卜素屬于脂溶性維生素，由于其分子中存在多個共軛雙鍵，對光、熱、氧不穩(wěn)定，易被氧化、降解而降低其生物學(xué)活性[13]。測定β-胡蘿卜素的方法主要有紙層析法、薄層層析法、柱層析法、分光光度法和高效液相色譜法等。薄層層析法、紙層析法及柱層析法只能對β-胡蘿卜素進行定性分析，要確定量的大小必須結(jié)合紫外分光光度計[14]。高效液相色譜法是目前測定β-胡蘿卜素含量最簡便的方法，其操作簡單、效率高、準確度高，還可同時測定α、β-胡蘿卜素及其他類胡蘿卜素[15]。劉秋芬等[16]以國家標準 GB/T 50089-2003的方法用HPLC法測定了8個南瓜品種果實中的β-胡蘿卜素，但該方法需經(jīng)過提取、濃縮、純化等復(fù)雜的前處理，測定樣品量較大時，難度增加。β-胡蘿卜素對許多物理、化學(xué)、生物因素都不穩(wěn)定，但其檢測前一般要經(jīng)過皂化、溶劑萃取、分離、濃縮等多次操作，檢測前的步驟越多，越易對β-胡蘿卜素造成損失[14]。Sarungallo等[17]采用柱切換技術(shù)完成食品添加劑中的β-胡蘿卜素的在線準備與分離，該方法節(jié)省了大量檢測前期工作，但由于需要利用色譜柱切換技術(shù)，因此其應(yīng)用目前還較少。本次實驗中β-胡蘿卜素的提取、檢測過程簡單，不需要經(jīng)過復(fù)雜的純化步驟，且建立的方法重復(fù)性好(RSD=5.11%)，精密度高(RSD=0.70%)，穩(wěn)定性好(RSD=2.73%)，加標回收結(jié)果準確可靠(RSD=2.06%)。在35 min內(nèi)較好地將β-胡蘿卜素進行了分離，峰型對稱、基線平穩(wěn)、分離度高。色譜分離過程中的流動相為丙酮和水，無需調(diào)節(jié)酸堿，流動相中無鹽離子，對色譜柱較溫和。

4 結(jié)論

本實驗以丙酮和水作為流動相，采用梯度洗脫的方式，較好地將β-胡蘿卜素在35min內(nèi)進行了分離，且測定結(jié)果的重復(fù)性好(RSD=5.11%)，精密度高(RSD=0.70%)，穩(wěn)定性好(RSD=2.73%)，加標回收結(jié)果準確可靠(RSD=2.06%)。以此色譜條件測定12份南瓜材料中的β-胡蘿卜素含量，其結(jié)果表明：12份南瓜樣品中β-胡蘿卜素含量差異較大，印度南瓜16296-1中β-胡蘿卜素含量最高，為94.4μg/g，其次為中國南瓜9132、印度南瓜16291-2、印度南瓜16167-8，含量均≥76μg/g，含量最低的印度南瓜16185-6，僅有8.9μg/g。◇

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(責(zé)任編輯 李婷婷)

Determination on β-carotene in Fresh Pumpkin by HPLC Method

DENG Jun-lin1，ZHU Yong-qing1，LIU Xiao-jun2，YANG Hong2，LIANG Gen-yun2，CHEN Jian1，XIA Chen1，ZHANG Ying-jiao1，LI Juan1
(1Institute of Agro-Products Processing Science and Technology，Sichuan Academy of Agricultural Sciences，Chengdu 610066，China；2Institute of Horticulture Research Institute，Sichuan Academy of Agricultural Sciences/Vegetable Germplasm Innovation and Variety Improvement Key Laboratory of Sichuan Province，Chengdu 610066，China)

pumpkin；β-carotene；HPLC

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項經(jīng)費(項目編號：201303112)；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項資金資助(項目編號：CARS-23-G32)。

鄧俊琳(1988— )，女，研究實習(xí)員，研究方向：功能食品加工。

劉小俊(1972— )，男，研究員，研究方向：瓜類育種。