氧化亞氮-氧氣混合吸入口腔鎮(zhèn)靜效果及對老年口腔細(xì)胞DNA損傷和糖酵解的影響

張燕升 韓 博 胡曉敏 謝培培 王嘉欣

(北京市崇文口腔醫(yī)院綜合治療科，北京 100062)

氧化亞氮-氧氣混合吸入口腔鎮(zhèn)靜效果及對老年口腔細(xì)胞DNA損傷和糖酵解的影響

張燕升 韓 博 胡曉敏 謝培培 王嘉欣

(北京市崇文口腔醫(yī)院綜合治療科，北京 100062)

目的探討氧化亞氮-氧氣混合吸入對老年口腔鎮(zhèn)靜效果及其對口腔黏膜上皮細(xì)胞DNA損傷和糖酵解影響。方法擬行口腔頜面診治的老年患者792例，隨機(jī)分為氧化亞氮組392例和單純局麻組400例。術(shù)前和術(shù)中記錄患者心率和血氧飽和度；使用視覺模擬疼痛評(píng)分(VAS)和Ramsay法評(píng)估患者的疼痛和鎮(zhèn)靜情況。術(shù)中取牙齦黏膜，體外常規(guī)培養(yǎng)口腔黏膜上皮細(xì)胞，Western印跡法和細(xì)胞免疫熒光檢測氧化亞氮-氧氣處理不同時(shí)間細(xì)胞中γH2AX蛋白表達(dá)情況；RT-PCR檢測細(xì)胞糖酵解酶基因(GLUT1、GLUT3、HK2、PK-M2)表達(dá)情況。結(jié)果單純局麻組心率動(dòng)幅較大，112例心率波動(dòng)超出正常范圍；氧化亞氮組術(shù)前和術(shù)中心率均在正常范圍內(nèi)；術(shù)中氧化亞氮組血氧飽和度高于術(shù)前和單純局麻組(P<0.05)。氧化亞氮組術(shù)中VAS低于單純局麻組，鎮(zhèn)靜評(píng)分高于單純局麻組(P<0.05)。氧化亞氮-氧氣處理口腔黏膜上皮細(xì)胞0.5 h后γH2AX蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，1 h達(dá)到高峰，之后逐漸降低；細(xì)胞免疫熒光檢測γH2AX蛋白表達(dá)情況顯示，處理2 h時(shí)熒光強(qiáng)度高于處理前，說明氧化亞氮-氧氣誘導(dǎo)γH2AX表達(dá)上調(diào)，誘導(dǎo)細(xì)胞DNA損傷。口腔黏膜上皮細(xì)胞糖酵解基因經(jīng)氧化亞氮-氧氣處理后表達(dá)均上調(diào)，其中GLUT1和GLUT3基因明顯上調(diào)，2 h后達(dá)到高峰，之后下降。結(jié)論氧化亞氮-氧氣混合吸入配合局麻對老年口腔頜面手術(shù)患者具有較好的鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛效果；但氧化亞氮會(huì)誘導(dǎo)口腔黏膜上皮細(xì)胞DNA損傷，促進(jìn)糖酵解，易引發(fā)術(shù)后口腔疾病，應(yīng)加以預(yù)防。

氧化亞氮-氧氣；鎮(zhèn)靜；口腔黏膜上皮細(xì)胞；DNA損傷；糖酵解

疼痛是口腔頜面疾病治療中的常見問題，因口腔淺表腫物切除、復(fù)雜牙等手術(shù)時(shí)間長，損傷較大，單純局麻難以獲得理想效果〔1〕。近年來，氧化亞氮-氧氣混合吸入配合局麻進(jìn)行上述復(fù)雜手術(shù)逐漸在臨床推廣。氧化亞氮是一種對呼吸道刺激小，不損傷心、肺等重要器官且不與血紅蛋白結(jié)合的安全麻醉劑。但有研究顯示，氧化亞氮會(huì)影響細(xì)胞的正常生理功能，引發(fā)口腔疾病〔2〕。細(xì)胞DNA損傷早期，損傷部位組蛋白H2AX迅速磷酸化，形成γH2AX蛋白，修復(fù)DNA，而在此過程中需通過糖酵解提供能量〔3〕。本研究旨在探討氧化亞氮-氧氣混合吸入配合局麻鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛的效果及對細(xì)胞DNA損傷和糖酵解的影響。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年1～12月在北京市崇文口腔醫(yī)院口腔頜面外科就診的老年患者792例，入選標(biāo)準(zhǔn)：美國麻醉師協(xié)會(huì)(ASA)分級(jí)Ⅰ～Ⅱ級(jí)，知情同意。隨機(jī)分為氧化亞氮組392例和單純局麻組400例。氧化亞氮組中男185例，女207例，年齡60～75〔平均(65.96±5.31)〕歲。單純局麻組男190例，女210例，年齡60～78〔平均(66.31±7.06)〕歲。兩組患者性別、年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1麻醉和評(píng)分 一氧化亞氮組將雙層鼻罩置于氧化亞氮組鼻部，氧氣初始流量6～8 L/min，氧化亞氮初始流量1 L/min，根據(jù)患者感覺每次可增加0.5～1 L/min，同時(shí)減少氧氣流量，保持總通氣量不變，觀察患者意識(shí)模糊時(shí)為起效，之后使用2%利多卡因局麻后開始手術(shù)。單純局麻組直接使用2%利多卡因局部浸潤麻醉后進(jìn)行手術(shù)。術(shù)中分別使用視覺模擬疼痛評(píng)分(VAS)和Ramsay法評(píng)估患者的疼痛和鎮(zhèn)靜情況。分別與術(shù)前和術(shù)中監(jiān)測并記錄患者心率和血氧飽和度。

1.2.2口腔黏膜上皮細(xì)胞培養(yǎng) 術(shù)中取牙齦黏膜，將組織塊洗凈后除去皮下結(jié)締組織，剪成邊長為1 mm的小塊，接種到25 mm培養(yǎng)瓶中，加1 ml MCDB153無血清培養(yǎng)基，放入二氧化碳(CO2)細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，上皮細(xì)胞布滿培養(yǎng)皿底部時(shí)傳代。吸出培養(yǎng)液，胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液，按1×105/ml的密度接種到含10%胎牛血清(BSA)的DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.3Western印跡檢測 取對數(shù)生長期的口腔黏膜上皮細(xì)胞消化，按1×106/ml密度接種到培養(yǎng)瓶，孵育過夜。氧化亞氮-氧氣(1∶1)混合氣體處理細(xì)胞，分別培養(yǎng)0、0.5、1、2、4 h，RIPA裂解液提蛋白，定量、變性后上樣，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯凝膠(SDS-PAGE)電泳，濕法轉(zhuǎn)膜，室溫下5%BSA封閉液中處理1 h，滴加一抗γH2AX(1∶500)和內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)，孵育12 h，加二抗，室溫孵育2 h，分析灰度值。

1.2.4細(xì)胞免疫熒光 按1×104/ml密度接種到12孔板中，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，常規(guī)孵育24 h。氧化亞氮-氧氣(1∶1)混合氣體處理細(xì)胞，培養(yǎng)2 h后棄去培養(yǎng)液，室溫下4%多聚甲醛固定40 min，0.3%Triton+5%BSA破膜并封閉1 h，滴加一抗γH2AX(1∶500)孵育過夜，滴加異肽酸己二烯(DAPI)工作液染核，室溫20 min，倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5RT-PCR檢測 口腔黏膜上皮細(xì)胞按1×106/ml密度接種到6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)過夜，氧化亞氮-氧氣(1∶1)混合氣體處理細(xì)胞，分別培養(yǎng)0、0.5、1、2、3 h，Trizol提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。反應(yīng)體系20 μl(cDNA 2 μl、上游和下游引物各1 μl、SYBR Green熒光染料 10 μl、雙蒸水6 μl)，常規(guī)條件下反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。引物為糖酵解相關(guān)酶基因，包括GLUT1、GLUT3、HK2、PK-M2，由武漢金開瑞生物工程有限公司合成。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1兩組心率和血氧飽和度變化情況 單純局麻組心率動(dòng)幅較大，112例心率波動(dòng)超出正常范圍；氧化亞氮組術(shù)前和術(shù)中心率均在正常范圍內(nèi)。氧化亞氮組、單純局麻組術(shù)前心率分別為(83.95±13.28)次/min、(84.86±13.21)次/min；術(shù)中分別為(75.92±11.05)次/min、(85.76±14.18)次/min。術(shù)中氧化亞氮組心率低于術(shù)前和單純局麻組(P<0.05)。氧化亞氮組、單純局麻組術(shù)前血氧飽和度分別為(99.18±2.73)ml/dl、(98.12±1.90)ml/dl；術(shù)中分別為(100.68±1.63)ml/dl、(99.49±1.85)ml/dl。術(shù)中氧化亞氮組高于術(shù)前和單純局麻組(P<0.05)。

2.2兩組疼痛和鎮(zhèn)靜評(píng)分情況 單純局麻組術(shù)中VAS 1～5分，平均(3.72±0.83)分；氧化亞氮組術(shù)中VAS 0～2分，平均(1.65±0.42)分；兩組VAS差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。單純局麻組術(shù)中鎮(zhèn)靜評(píng)分(1.16±0.33)分，氧化亞氮組(2.92±0.54)分；兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3氧化亞氮-氧氣誘導(dǎo)口腔黏膜上皮細(xì)胞DNA損傷 處理0.5 h后γH2AX蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，1 h達(dá)到高峰，之后逐漸降低。見圖1。細(xì)胞免疫熒光檢測γH2AX蛋白表達(dá)情況顯示，處理2 h時(shí)熒光強(qiáng)度高于處理前，說明氧化亞氮-氧氣誘導(dǎo)γH2AX表達(dá)上調(diào)，誘導(dǎo)口腔黏膜上皮細(xì)胞DNA損傷。見圖2。

2.4氧化亞氮-氧氣上調(diào)口腔黏膜上皮細(xì)胞糖酵解相關(guān)酶mRNA表達(dá) 口腔黏膜上皮細(xì)胞糖酵解酶基因經(jīng)氧化亞氮-氧氣處理后表達(dá)均上調(diào)，其中GLUT1和GLUT3基因明顯上調(diào)，2 h后達(dá)到高峰，之后下降。見表1。

表1 各時(shí)間點(diǎn)口腔黏膜上皮細(xì)胞糖酵解酶基因mRNA表達(dá)情況

3 討 論

氧化亞氮-氧氣混合氣體吸入為個(gè)性化陣痛鎮(zhèn)靜方案，有效提升口腔治療的舒適性，目前臨床中已逐漸推廣應(yīng)用〔4〕。本研究結(jié)果也證實(shí)該鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜方案較單純局麻更適用于接受口腔頜面手術(shù)的老年患者，對患者心率和血氧飽和度影響小，鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛效果明顯。在細(xì)胞DNA損傷早期，損傷部位組蛋白H2AX迅速磷酸化，形成γH2AX蛋白，修復(fù)DNA。本研究說明早期細(xì)胞出現(xiàn)DNA損傷，隨著γH2AX蛋白表達(dá)水平上述，DNA損傷逐漸被修復(fù)，但難以恢復(fù)正常水平。同時(shí)DNA修復(fù)過程需消化能量，口腔上皮細(xì)胞需通過增加糖酵解來實(shí)現(xiàn)〔5〕。本研究也進(jìn)一步證實(shí)了γH2AX蛋白DNA損傷修復(fù)過程，通過干預(yù)手段提升糖糖酵解作用有助于患者口腔黏膜上皮細(xì)胞DNA損傷的修復(fù)。因此，臨床給予老年口腔患者氧化亞氮-氧氣混合氣體鎮(zhèn)靜疼痛過程中應(yīng)盡量避免氣體進(jìn)入口腔，并在術(shù)后給予促進(jìn)糖酵解的藥物來提升口腔黏膜上皮細(xì)胞DNA損傷的修復(fù)程度，預(yù)防術(shù)后口腔疾病的發(fā)生。

1張文文，葉保國，韓春瑩，等.兩種控制通氣模式對老年患者喉罩麻醉下行腹腔鏡手術(shù)時(shí)呼吸功能的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2012；32(2)：387-8.

2Stieglmeier M，Mooshammer M，Kitzler B,etal.Aerobic nitrous oxide production through N-nitrosating hybrid formation in ammonia-oxidizing archaea〔J〕.ISME J，2014；8(5)：1135-46.

3付建平，袁蘭所，牟麗娜，等.依折麥布對高遷移率族蛋白1誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞激活的影響機(jī)制研究〔J〕.北華大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2017；18(1)：46-9.

4高友光，林財(cái)珠，林獻(xiàn)忠，等.氧化亞氮復(fù)合七氟醚長時(shí)間吸入對腫瘤患者術(shù)后骨髓功能的影響〔J〕.臨床麻醉學(xué)雜志，2011；27(9)：841-3.

5孫黎生.戊乙奎醚對老年口腔手術(shù)患者呼吸及循環(huán)系統(tǒng)的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2011；31(17)：3382-3.

〔2017-06-23修回〕

(編輯 袁左鳴)

張燕升(1975-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事口腔科研究。

R78

A

1005-9202(2017)17-4337-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.17.081