白細胞介素-21和Blimp1 mRNA在老年類風濕關節炎患者外周血單個核細胞的表達及作用機制

侯艷香

(山西醫科大學汾陽學院醫學檢驗系，山西 汾陽 032200)

白細胞介素-21和Blimp1 mRNA在老年類風濕關節炎患者外周血單個核細胞的表達及作用機制

侯艷香

(山西醫科大學汾陽學院醫學檢驗系，山西 汾陽 032200)

目的探討白細胞介素(IL)-21和Blimp1 mRNA在老年類風濕關節炎患者外周血單個核細胞(PBMCs)的表達及作用機制。方法老年類風濕關節炎患者62例，同期體檢的健康老年人45名作為對照。取外周靜脈血分離PBMC和血漿，酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法檢測血漿中IL-21水平，分析DAS28、抗CCP抗體與IL-21的相關性；實時熒光定量PCR檢測患者PBMCs中Blimp1 mRNA表達量；使用IL-21、CD40L刺激PBMCs 72 h后檢測Blimp1 mRNA表達量，流式細胞術檢測各組CD138+細胞比例。結果類風濕關節炎患者血漿IL-21含量明顯高于對照組(P<0.01)。血漿IL-21含量與類風濕關節炎患者DAS28、抗CCP抗體具有明顯相關性(r=0.769、0.785，P<0.05)。類風濕關節炎患者PBMCs中Blimp1 mRNA表達量明顯高于對照組(P<0.05)。IL-21、CD40L體外刺激后，對照組與CD40L組Blimp1 mRNA表達水平之間差異無統計學意義(P>0.05)；IL-21組、IL-21+CD40L組Blimp1 mRNA表達水平均明顯高于對照組(P<0.01)；IL-21+CD40L組明顯高于IL-21組(P<0.05)。流式細胞術顯示，IL-21+CD40L組CD138+細胞比例明顯高于CD40L組和IL-21組(P<0.05)。結論IL-21可促進老年類風濕關節炎患者PBMCs中Blimp1 mRNA表達，IL-21與CD40L協同作用可通過調節Blimp1 mRNA表達促進B淋巴細胞分化并參與類風濕性關節炎的發病。

類風濕關節炎；白細胞介素-21；Blimp1

老年類風濕關節炎患者多合并心肺等基礎疾病，病情進展迅速且易反復，治療難度大〔1〕。研究發現，白細胞介素(IL)-21可能通過JAK-STAT通路誘導B淋巴細胞分化為漿細胞〔2〕，但是否存在其他調控機制仍需進一步研究。Blimp1可轉錄調節B淋巴細胞分化和漿細胞分泌免疫球蛋白，其在自身免疫方面作用研究較少。類風濕關節炎屬于自身免疫性疾病，存在類風濕因子、抗CCP抗體異常升高等B淋巴細胞相關異常改變〔3〕。目前關于風濕關節炎患者體內Blimp1表達情況和IL-21的調節作用仍鮮有報道，本研究旨在分析老年類風濕關節炎患者體內Blimp1和IL-21的表達情況及作用機制。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年1月至2016年6月醫院收治確診為類風濕關節炎的老年患者62例，其中男17例，女45例；年齡60～75歲，平均(67.31±6.08)歲；關節活動指數為(4±1)，處于風濕關節炎中度活動期；給予口服甲氨蝶呤15 mg/w與鹽酸潑尼松片10 mg/d聯合治療。選擇同期在本院體檢的健康老年人45名為對照組，其中男38名，女7名；年齡60～78歲，平均(68.15±7.20)歲。入選受試者采血前未使用抗凝劑，采集的空腹肘靜脈血經抗凝處理后無明顯溶血，兩組性別、年齡差異均無統計學意義(P>0.05)。

1.2主要試劑與儀器 人外周血淋巴細胞分離液(上海朗頓生物科技有限公司)，RT-PCR試劑盒、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)，Trizol試劑(杭州新景生物試劑開發有限公司)，CD40L、CD20PE、CD138PE抗體(南京森貝伽生物科技有限公司)。羅氏LightCycler480熒光定量PCR儀，貝克曼Quanta SC流式細胞儀。

1.3方法

1.3.1血漿IL-21水平檢測 采用ELISA法檢測，將100 μl血漿和各濃度標準品溶液加入96孔板，每孔加入100 μl的酶標志物，放入37℃保溫箱中反應60 min，甩去孔內液體，磷酸緩沖液洗滌后晾干，加顯色液A和B，振蕩混勻后放入暗室中反應20 min，加終止液，放入酶標儀讀取450 nm波長處每孔的吸光度值。

1.3.2實時熒光定量PCR檢測 提取兩組外周單個核細胞(PBMCs)總RNA，檢測純度符合反轉錄要求后合成cDNA；實時熒光定量PCR反應總Blimp1 mRNA表達量，反應體系20 μl(cDNA 2 μl，上游引物、下游引物各1 μl，TaqDNA聚合酶10 μl，蒸餾水6 μl)。常規反應條件下共40個循環，以健康老年人為對照計算類風濕關節炎患者mRNA相對表達量。

1.3.3類風濕關節炎患者PBMCs培養及Blimp1 mRNA表達檢測 將分離的PBMCs用含10%胎牛血清的DMEM細胞培養基調整密度為1×106/ml并加入96孔板，每孔200 μl，放入CO2細胞培養箱中孵育。依據細胞培養孔中是否加IL-21、CD40L將PBMCs分為空白對照組、IL-21組(200 ng/ml)、CD40L組(5 μg/ml)、IL-21+CD40L組，均孵育48 h，Trizol法提取細胞總RNA并測定其濃度，吸光度值1.8～2.0，放入超低溫冰箱中凍存。熒光定量PCR測定IL-21刺激對Blimp1 mRNA表達的影響，流式細胞術檢測IL-21+CD40L刺激后PBMCs培養72 h后細胞中CD138+細胞的比例，使用FlowJo 7.6軟件分析。

1.4統計學分析 使用SPSS20.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1兩組IL-21含量比較 觀察組IL-21含量為(129.62±9.48)ng/L，明顯高于對照組的(26.57±5.85)ng/L(P<0.01)。血漿IL-21含量與類風濕關節炎患者DAS28、抗CCP抗體具有明顯相關性(r=0.769、0.785，P<0.05)。見圖1。

圖1 IL-21與類風濕關節炎患者DAS28、抗CCP抗體的相關性

2.2兩組PBMCs中Blimp1 mRNA表達情況 觀察組PBMCs中Blimp1 mRNA表達量(1.43±0.22)明顯高于對照組(1.00±0.00)(P<0.05)。

2.3IL-21、CD40L刺激對PBMCs中Blimp1 mRNA表達的影響 對照組、CD40L組、IL-21組、IL-21+CD40L組的Blimp1 mRNA表達量分別(1.00±0.00)、(1.03±0.05)、(1.19±0.03)、(1.26±0.05)，4組差異有統計學意義(P<0.05)；其中對照組與CD40L組差異無統計學意義(P>0.05)；IL-21組、IL-21+CD40L組明顯高于對照組(P<0.01)；IL-21+CD40L組明顯高于IL-21組(P<0.05)。

2.4IL-21、CD40L刺激對PBMCs中CD138+細胞比例的影響 CD40L組、IL-21組、IL-21+CD40L組CD138+細胞比例分別為(0.58±0.22)、(0.76±0.24)、(0.92±0.28)，其中IL-21+CD40L組明顯高于CD40L組和IL-21組(P<0.05)。

3 討 論

研究發現，類風濕關節炎的發病機制除T淋巴細胞活化外還與B淋巴細胞功能亢進相關，B淋巴細胞可通過抗原傳遞、分泌細胞因子、產生自身抗體等途徑在促進類風濕關節炎病情進展〔4〕。目前B淋巴細胞清除療法已在類風濕關節炎患者中取得較好的療效。細胞因子可在淋巴細胞活化、細胞間信號傳導方面起到重要作用，也參與了類風濕關節炎患者滑膜炎性病變過程〔5〕。盡管目前靶向淋巴細胞和炎性細胞因子共刺激等治療手段快速發展，但療效仍不理想，同時較嚴重的不良反應更是嚴重影響老年類風濕關節炎患者的預后。

IL-21可與IL-21R結合后對機體免疫系統中多種細胞增殖、分化、功能成熟發揮調節作用。相關研究顯示，IL-21可有效促進類風濕關節炎患者CD4+T細胞活化和破骨細胞生成，發揮骨折破壞、刺激滑膜中金屬蛋白酶釋放的作用，參與關節病變的進展〔6〕，阻斷IL-21有望成為類風濕關節炎治療的新途徑。在CD40刺激下IL-21可刺激B淋巴細胞快速增殖、漿細胞分化，Blimp1基因是漿細胞分化的重要調控子，是漿細胞生成和維持的重要條件，有研究發現，Blimp1基因異常表達可促使B細胞系分化為漿細胞〔7〕。CD138是漿細胞中特異性抗原，可作為成熟漿細胞的特異性標志物，CD138+細胞比例增加提示漿細胞數增加與Blimp1基因高表達。

1Chu Y，Wang F，Zhou M,etal.A preliminary study on the characterization of follicular helper T (Tfh) cells in rheumatoid arthritis synovium〔J〕.Acta Histochemica，2014；116(3)：539-43.

2孫 波，宋玉國，王 華，等.類風濕關節炎患者關節液中IL-17的定量檢測〔J〕.北華大學學報(自然科學版)，2014；15(5)：620-2.

3林錦驃.Cyr61在類風濕性關節炎炎癥微環境中的作用及其調控機制〔D〕.上海：上海交通大學，2013.

4Huang QQ，Pope RM.The role of glycoprotein 96 in the persistent inflammation of rheumatoid arthritis〔J〕.Arch Biochem Biophys，2013；530(1)：1-6.

5Lee SS，Xin XH，Lee WP,etal.The feasibility of using SMS as a health survey tool：an exploratory study in patients with rheumatoid arthritis〔J〕.Int J Med Inform，2013；82(5)：427-34.

6吳昌順.Furin和PCSK6對類風濕性關節炎成纖維樣滑膜細胞生物學功能的影響〔D〕.濟南：山東大學，2015.

7Gabriel D，Lange N，Chobaz-Peclat V，etal.Thrombin-sensitive dual fluores imaging and therapeutic agent for detection and treatment of synovial inflammation in murine rheumatoid arthritis〔J〕.J Control Release，2012；163(2)：178-86.

〔2016-10-18修回〕

(編輯 郭 菁/滕欣航)

侯艷香(1977-)，女，實驗師，主要從事臨床檢驗及血液檢驗研究。

R593.22

A

1005-9202(2017)17-4209-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.17.018