VEGFR-2分子探針超聲分子成像評價小鼠下肢缺血性血管新生的可行性

趙 璇 紀偉英

(華中科技大學同濟醫學院附屬武漢兒童醫院(武漢市婦幼保健院)，湖北 武漢 430100)

VEGFR-2分子探針超聲分子成像評價小鼠下肢缺血性血管新生的可行性

趙 璇 紀偉英

(華中科技大學同濟醫學院附屬武漢兒童醫院(武漢市婦幼保健院)，湖北 武漢 430100)

目的探討血管內皮細生長因子受體(VEGFR)-2分子探針的超聲分子成像評價小鼠下肢缺血性血管新生可行性。方法將10只實驗小鼠麻醉后結扎一側下肢股動脈制備下肢缺血模型，術后第7天，所有小鼠隨機經尾靜脈注入攜抗小鼠VEGFR-2靶向微泡(MbVEGFR-2)和攜同型抗體對照微泡(Mbc)，并行超聲分子檢查，測量雙下肢的顯影強度(VI)值，并處死小鼠后對骨骼肌進行免疫組化檢查。結果經過8 min循環時間后，MbVEGFR-2組小鼠可見明顯的超聲顯影，Mbc組小鼠可見輕度超聲顯影，但其顯影強度明顯弱于MbVEGFR-2組；在非缺血小鼠下肢，經過8 min循環時間后，MbVEGFR-2組和Mbc組小鼠均未見明顯的超聲顯影；缺血下肢實驗小鼠MbVEGFR-2的VI值明顯高于Mbc和非缺血下肢實驗小鼠(P<0.01)，缺血下肢實驗小鼠Mbc的VI值高于非缺血下肢實驗小鼠(P<0.05)，非缺血下肢骨骼肌VI值在MbVEGFR-2和Mbc之間差異無統計學意義(P>0.05)；DAB染色結果顯示下肢缺血小鼠骨骼肌血管有VEGFR-2表達，而下肢非缺血小鼠骨骼肌血管中未見VEGFR-2表達。結論采用攜VEGFR-2分子探針的超聲成像對缺血下肢新血管進行造影可行，為評價缺血性血管新生提供了病理學依據。

血管內皮生長因子受體-2；超聲；分子成像；血管新生

血管新生是缺血性疾病血管阻塞后改善機體自身恢復血流灌溉的重要機制〔1〕，通過無創的分子影像技術對新生血管的早期有效評價對于指導臨床缺血性心血管疾病的治療及療效評價具有重要意義。研究發現，血管內皮細生長因子受體(VEGFR)-2作為分子靶點的超聲分子顯影技術已在評價腫瘤組織血管新生領域得到成功應用〔2〕，但利用VEGFR-2分子探針的超聲顯影技術在評價缺血性血管新生方面鮮有報道。本研究通過建立小鼠下肢缺血模型，探討利用VEGFR-2分子探針的超聲分子成像評價小鼠下肢缺血性血管新生的可行性。

1 材料與方法

1.1材料 實驗動物：昆明雌性小鼠(清潔級)10只，10周齡，20～30 g，購自南方醫科大學實驗動物中心，合格證批號：scXK(粵)2016-015。主要實驗儀器：Sequoia 512 超聲心動圖儀(Siemens，德國)，DAKO Evision免疫組化顯色系統和(DAKO，丹麥)。主要實驗試劑：二棕櫚酰磷脂酰單件(DPPC，Sigma，美國)，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-生物素(DSPE-PEG2000-Biotin，Avanti，美國)，聚乙二醇(PEG，Applichem，德國)，鏈親和素(Streptavidin，Sigma，美國)，普羅沙姆-188(Poloxamer188，BASF，德國)，純化的大鼠抗小鼠VEGFR-2單克隆抗體(Purified Rat Anti-Mouse VEGFR-2，EB，美國)，生物素化的大鼠抗小鼠VEGFR-2單克隆抗體(Biotin Rat Anti-Mouse VEGFR-2，EB，美國)。

1.2方法

1.2.1VEGFR-2靶向微泡(MbVEGFR-2)和攜同型抗體對照微泡(Mbc)的制備 將DPPC、DSPE-PEG2000-Biotin、PEG等脂質材料按照事先確定的比例溶解于一定量的蒸餾水中，同時通入全氟丙烷(C3F8)氣體，通過超聲振蕩形成白色液體得到生物化的脂質微泡。然后將生物化的脂質微泡靜置并棄除下清液中純化的微泡，加入Streptavidin和Purified Rat Anti-Mouse VEGFR-2或同型抗體，制備成攜Purified Rat Anti-MouseMbVEGFR-2和Mbc。

1.2.2動物準備 將10只小鼠采用戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉后，仰臥位固定于鼠板上，于雙下肢及腹股溝區域備皮，切開腹股溝區域皮膚，分離出股動脈及其分支，結扎并剪斷股動脈及其分支，通過肉眼觀察到下肢皮膚發生明顯變化時，方可縫合手術切口。

1.2.3超聲分子成像 將小鼠采用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，然后四肢固定于鼠板上。尾靜脈插留置針用于微泡注射，置自制水囊于小鼠雙側下肢上，用自制支架固定超聲探頭(17L5)于固定的小鼠雙側下肢上，不斷調試探頭位置以獲得良好的下肢顯像并保證在整個實驗過程中不發生位移。超聲分子成像基于二次諧波成像技術，儀器的各項參數：探頭發射頻率為7.0 MHz，接收頻率為14 MHz，機械指數(MI)為0.18，超聲發射間隔為10 s。超聲分子成像通過尾靜脈間隔30 min隨機注射MbVEGFR-2和Mbc(約5×107個)。在循環時間達到8 min后獲取實驗小鼠的第一幀顯影圖像(組織本地和下肢中滯留微泡)，此后連續超聲發射3 s以破壞微泡，10 s后再次獲取實驗小鼠第二幀圖像(組織本地)，實驗中所有實驗小鼠的超聲造影圖像存盤，用于數據分析。

1.2.4MCE圖像分析 采用MCE圖像分析軟件(美國Virginia大學)對所獲取的超聲圖像進行分析，測量實驗小鼠下肢骨骼肌超聲顯影的聲強度(VI)，并利用彩色編碼技術制作下肢骨骼肌顯影的彩色編碼圖像，紅色、橙色及白色分別表示顯影強度由弱到強變化。

1.2.5免疫組化 超聲造影結束后，立刻處死實驗小鼠并取雙側骨骼肌，4%多聚甲醛固定。制備冰凍切片，嚴格按照說明書孵育抗小鼠VEGFR-2以及辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊大鼠二抗，后行二氨基聯苯胺(DAB)染色，蘇木素復染，最后于顯微鏡下觀察并拍照。

1.3統計學方法 應用SPSS19.0軟件進行t檢驗、方差分析。

2 結 果

2.1超聲分子成像檢查情況 在缺血小鼠下肢，經過8 min循環時間后，MbVEGFR-2組小鼠可見明顯的超聲顯影，Mbc組小鼠可見輕度超聲顯影，但其顯影強度明顯弱于MbVEGFR-2組；在非缺血小鼠下肢，經過8 min循環時間后，MbVEGFR-2組和Mbc組小鼠均未見明顯的超聲顯影。見圖1。

圖1 缺血和非缺血小鼠下肢超聲分子成像

2.2超聲VI值分析 缺血下肢實驗小鼠MbVEGFR-2的VI值〔(22.57±5.42)U〕明顯高于Mbc〔(7.06±1.64)U，P<0.01〕，也明顯高于非缺血下肢實驗小鼠〔(4.62±1.18)U,P<0.01〕，缺血下肢實驗小鼠Mbc的VI值高于非缺血下肢實驗小鼠〔(4.85±1.23)U,P<0.05〕，非缺血下肢骨骼肌VI值在MbVEGFR-2和Mbc組間差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3免疫組化結果 DAB染色結果顯示下肢缺血小鼠骨骼肌血管有VEGFR-2表達，棕黃色陽性顆粒大量存在，而下肢非缺血小鼠骨骼肌血管中未見VEGFR-2表達。見圖2。

圖2 小鼠下肢骨骼肌免疫組化DAB染色結果

3 討 論

隨著人口老齡化的加劇，老年人下肢缺血的發病率呈現上升趨勢〔3〕。下肢缺血是由動脈硬化閉塞和血管閉塞性脈管炎引起的，屬于常見的血管疾病。當組織出現缺血缺氧時，機體可產生多種細胞因子作用于缺血區域，例如腫瘤壞死因子(TNF)-α、堿性成纖維細胞生長因子(FGF)-2，血管生成素(Angs)、血管內皮生長因子(VEGF)等促進形成新血管〔4〕，從而使局部缺血缺氧組織供血狀況得到改善。研究發現，VEGF可通過與血管內皮細胞上表達的VEGFR-2相結合，導致內皮細胞管道形成，在心血管形成過程中起著至關重要的作用〔5〕。

本研究結果顯示，MbVEGFR-2組小鼠可見明顯的超聲顯影，Mbc組小鼠可見輕度超聲顯影，但其顯影強度明顯弱于組；在非缺血小鼠下肢，經過8 min循環時間后，MbVEGFR-2組和Mbc組小鼠均未見明顯的超聲顯影，這主要是由于MbVEGFR-2借助于攜帶的VEGFR-2抗體與下肢缺血處新生血管內皮VEGFR-2相結合，從而在超聲檢查時出現明顯的靶向超聲顯影，而Mbc攜帶的同型抗體因無法與新生血管內皮VEGFR-2結合而未出現明顯的超聲顯影〔6〕。在本次研究中Mbc小鼠缺血下肢VI值高于非缺血下肢的VI值，這可能與微泡在新生血管中有一定程度的滯留有關，其可能機制是小鼠下肢缺血的第7天，局部組織處于炎癥反應中，脂質微泡可能通過血清補體介導的調理作用及中性粒細胞和巨噬細胞對脂質微泡的“非免疫球蛋白依賴的吞噬作用”，使微泡長時間(30 min)保持完整，從而產生一定程度的“被動靶向顯影”〔7〕。本研究通過結扎小鼠下肢股動脈制備下肢缺血缺氧模型，并采用攜VEGFR-2分子探針的超聲成像對缺血下肢新血管進行造影，此方法可行，并為評價缺血性血管新生提供了病理學依據。

1張夢澤，李國珅，趙欣童，等.血管新生的分子機制與相關疾病〔J〕.中國病理生理雜志，2016；32(9)：1718-22，1728.

2張景瑤，周曉東，羅 文，等.載5-氟尿嘧啶腫瘤靶向超聲微泡的制備及其初步評價〔J〕.中國超聲醫學雜志，2013；29(7)：651-5.

3李維顏，張 毅.介入治療老年下肢動脈硬化閉塞癥患者的療效〔J〕.中國老年學雜志，2013；33(21)：5439-40.

4石 慧，王丹彤，烏日嘎等.TNF-α介導的NF-κB信號通路在類風濕性關節炎血管形成中的作用〔J〕.醫學綜述，2012；18(15)：2397-400.

5Orbay H，Hong H，Koch JM，etal.Pravastatin stimulates angiogenesis in a murine hindlimb ischemia model：a positron emission tomography imaging study with (64)Cu-NOTA-TRC105〔J〕.Am J Transl Res，2013；6(1)：54-63.

6鐘志惟，王 棟，殷香保，等.人源抗VEGFR-2/As2O3-PEG-PLA隱形納米粒的構建及質量控制研究〔J〕.重慶醫學，2016；45(36)：5041-4，5048.

7Lindner JR，Dayton PA，Coggins MP，etal.Noninvasive imaging of inflammation by ultrasound detection of phagocytosed microbubbles〔J〕.Circulation，2000；102(5)：53-8.

〔2017-01-25修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

紀偉英(1962-)，女，主任醫師，主要從事婦產科超聲研究。

趙 璇(1982-)，女，住院醫師，主要從事婦產科超聲研究。

R39

A

1005-9202(2017)17-4204-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.17.015