siRNA靶向沉默hTERT基因對宮頸癌Caski細胞特性的影響

王 彥 岳天孚

(天津市靜海縣醫院婦產科，天津 301600)

siRNA靶向沉默hTERT基因對宮頸癌Caski細胞特性的影響

王 彥 岳天孚1

(天津市靜海縣醫院婦產科，天津 301600)

目的研究siRNA靶向沉默hTERT基因后對宮頸癌Caski細胞特性的影響。方法設計、合成特異性針對hTERT mRNA的siRNA，將其克隆入pGenesil-1.1質粒中，重組成hTERT mRNA-siRNA的表達載體，導致目的基因沉默，是由電轉染入宮頸癌Caski細胞，從而產生RNA干擾作用。應用Western印跡法及RT-PCR法檢測沉默hTERT基因后對于宮頸癌Caski細胞的蛋白及mRNA的表達情況；檢測細胞周期運用流式細胞儀；沉默hTERT基因后宮頸癌Caski細胞的增殖能力可通過CCK-8 增殖實驗檢測。沉默hTERT基因后宮頸癌Caski細胞的侵襲能力可通過小室侵襲實驗檢測。結果hTERT基因沉默48 h以后，與空白組及未轉染組相比，轉染組宮頸癌Caski細胞的蛋白及mRNA表達出現明顯降低(P<0.05)；細胞周期的檢測結果顯示S期的細胞數目明顯減低，轉染組的宮頸癌Caski細胞停留于G0/G1周期，空白組、轉染組及未轉染組相比差異顯著(P<0.05)；宮頸癌Caski細胞在轉染組的增殖過程中被明顯抑制(P<0.05)；轉染組穿過濾膜的細胞數量明顯減少(P<0.05)。結論Si RNA靶向沉默hTERT基因電轉染后，使宮頸癌Caski細胞的增殖和遷移能力得到抑制，一定程度上改善了宮頸癌患者的預后。

宮頸癌；hTERT基因；基因沉默；Caski細胞特性；RNA干擾

宮頸癌的發病率與病死率位居女性惡性腫瘤的第二位〔1～3〕。我國統計數據顯示每年宮頸癌新發病例數已占全球的14.3‰，大約每年有3.4萬名婦女因患宮頸癌死亡〔4，5〕。目前，臨床上對于宮頸癌的復發、轉移、侵襲及預后不良等問題還尚未有好的方法。近些年來隨著干細胞移植及基因技術的發展，為宮頸癌的有效預防和治療帶來新的希望〔6～8〕。hTERT基因是非常重要的一種營養因子，對于原發性腫瘤、癌細胞系中均呈現高表達〔9〕，但是對于正常組織中并無表達，故具有重要的臨床價值和多重生物學效應。本研究采用沉默hTERT基因后電轉染入宮頸癌Caski細胞中，探討此法對宮頸癌治療的有效性。

1 材料和方法

1.1主要材料 由天津醫科大學中心實驗室惠贈人宮頸癌Caski細胞。DMEM培養液由美國Becon Dickinson公司生產，胎牛血清由美國Abcam公司生產，0.25%胰酶、Ⅱ膠原酶由Sigma公司生產，RT-PCR兩步法試劑盒、mRNA提取試劑盒由杭州吉諾公司生產，端粒酶反轉錄酶由本元正陽基因技術股份有限公司生產，siRNA鏈由美國HyClone公司生產，兔抗人hTERT多克隆抗體、β-actin兔抗鼠多克隆抗體和兔抗鼠MBP抗體由美國New Jersey公司生產，β-actin引物由上海Excell生物工程公司合成生產，AMV逆轉錄試劑盒由美國Sigma公司生產，Western試劑盒是美國Promega公司產品，Western印跡凝膠成像儀由FUJIFILM Corporation生產。

1.2設計合成及轉染hTERT的siRNA序列 設計hTERT siRNA引物(根據參考文獻〔10〕)序列為：上游引物：5′-CTGAAGTGTCACAGCCTGTTT-3′，下游引物：5′-CACACATGCGTGAAACCTGTA-3′，產物大?。?11 bp；β-actin上游引物：5′-TATCGGACGCCTGGTTAC-3′，下游引物：5′-CTCAGCCTTGACTGTGCC-3′，產物大?。?51 bp。PCR反應條件：94℃變性5 min，95℃變性30 s，54℃退火36 s，72℃延伸30 s，36個周期循環后，72℃延伸6 min。于4℃下保存產物。PCR反應重復進行3次。取5 ml PCR產物進行電泳，用β-actin作為內參照。放置GDSS000凝膠自動成像儀上拍照并保存，應用Image-Pro Plus8.0軟件對于β-actin條帶與hTERT的條帶灰度的相對比值進行mRNA半定量分析。DMEM培養基中培養宮頸癌Caski細胞，培養基中含10%小牛血清。5%CO2的飽和濕度培育箱中培育，置于37℃下恒溫密閉式。每2天傳代一次，把處于對數生長期的細胞經PBS清洗并由胰酶消化后，制成單細胞懸液離心收集Caski，用電穿孔緩沖液重懸，離心，靜置5 min，清洗細胞3次，離心，重懸于電轉液中，移至電擊杯，加入并混勻20 μg的質粒DNA，置于冰上30 min后，以電壓350 V/cm，電容25 μF，時間常數T為0.9 ms的電轉化參數，進行電穿孔。把轉染后的hTERT-Caski細胞，室溫放置30 min，細胞移入含10%小牛血清，1%雙抗的DMEM培養基中，5%CO2、37℃恒溫孵箱內培育。進行電轉染時分為3組：電轉染hTERT-siRNA載體者為Caski/hTERT-siRNA組(轉染組)；轉染NC siRNA載體者為Caski/control組(對照組)，未轉染的宮頸癌Caski細胞為Caski組(空白組)，并于轉染48 h后行RNA干擾效應的檢測。

1.3RT-PCR檢測沉默hTERT mRNA的表達 把處于對數生長期的宮頸癌細胞Caski，接種在10 cm2培養皿中，置于37℃、5%CO2，濕度飽和的培養箱至90%左右，運用cDNA合成試劑盒逆轉錄合成cDNA；運用TRIzol法提取總RNA。將產物cDNA反應結束后作為PCR反應模板，放置于-20℃冰箱中保存。設計特異性hTERT基因序列引物，hTERT和內參β-actin引物序列：上游引物：5′-CTGAAGTGTCACAGCCTGTTT-3′，下游引物：5′-CACACATGCGTGAAACCTGTA-3′，產物大?。?11 bp；β-actin上游引物：5′-TATCGGACGCCTGGTTAC-3′，下游引物：5′-CTCAGCCTTGACTGTGCC-3′，產物大?。?51 bp。待調制好PCR反應液后，設置PCR儀反應參數為：94℃變性5 min，95℃變性30 s，54℃退火36 s，72℃延伸30 s，循環35個周期后，終末延伸72℃、6 min。并于4℃下保存產物。PCR每一反應重復進行3次。取5 ml PCR產物經2%瓊脂糖凝膠進行電泳(152 V，90 min)。穩壓100 V電泳30 min后觀察結果，運用GDSS000凝膠自動成像儀電泳后顯像并拍照保存，判定擴增帶位于陽性擴增帶的標本為陽性，用hTERT/β-actin 代表hTERT mRNA的相對表達量。

1.4Westem印跡檢測沉默hTERT蛋白的表達 將宮頸癌Caski細胞胰酶消化后收集保存，棄掉培養液后沖洗3次，進行總蛋白的提取，采用BCA法檢測蛋白質濃度，吸取50 μg總蛋白。設置60 V電壓開始電泳，經電轉移以40 V、150 min的轉印條件下印跡到PVDF膜上，取出PVDF膜浸后泡入5%脫脂奶粉的FIBS液中封閉，37℃下孵育2 h。一抗孵育：加入hTERT多克隆一抗，稀釋濃度1∶1 000，4℃過夜，洗膜5次，5 min/次，二抗孵育：加入HRP標記的GAPDH和二抗，稀釋濃度1∶5 000，37℃下孵育2 h，PBS洗滌后運用ECL法檢測。暗室曝光X 光片，通過GDSS000凝膠自動成像系統攝像，漂洗并干燥后避光保存圖片。Image-Pro Plus8.0 軟件分析條帶灰度值，以h TERT/GAPDH代表代表hTERT的相對表達量。

1.5流式細胞儀檢測細胞周期變化 將以上三組Caski細胞收集，細胞濃度調整為1×106L-1，冷PBS清洗兩遍后，用70%的冷乙醇(4℃)將細胞沉淀后混勻備用，細胞洗滌后再調整細胞濃度為1×106L-1(用PBS)與含50 μg/ml RNA 酶的Tris-Hcl緩沖液(pH7.4) 共同孵育30 min。用100 μg/ml碘化丙啶(PI)對細胞DNA染色，暗室中放置1 h，運用流式細胞儀檢測細胞DNA含量及分布，并計算各周期細胞所占百分比。

1.6小室侵襲實驗檢測Caski細胞侵襲能力 將Caski細胞種于Transwell小室的上室，聚碳酸酯膜上室側鋪上一層基質膠。在聚碳酸酯微孔濾膜上以50 μg/孔鋪Matrigel，在Transwell小室下室中加入胎牛血清作為條件培養液。體積分數為10%。把處理過的Caski細胞懸液100 μl(3×105/L)，溶膠后置于4℃下培養24 h；PBS漂洗3遍，重懸細胞，獲取消化后的細胞；并于35℃下孵育，觀察細胞遷移結果并進行染色和計數，用蘇木精染色10 min，以PBS沖洗小室，將上室的聚碳酸酯濾膜待自然風干后沿邊緣小心取下，并固定于載玻片上，固定時膜外面朝下，封片后進行干燥，200×光鏡下每膜直徑上分別于左、右、上、下、中計數5個視野的侵襲細胞數目，并計算出其平均值。實驗重復3次，每組設定3個平行小室。

1.7CCK-8實驗檢測Caski細胞的增殖能力 將轉染后各組處于對數生長期Caski細胞收集，胰酶消化后采用有血清培養皿配制成的單細胞懸液。以每孔1×103個細胞接種在96孔板中，并在每組設6個復孔，培育24 h后，于轉染后1～4 d，每天各取96孔板經CCK-8試劑室溫融化，每孔里加入CCK-8 20 μl，Caski細胞的增殖情況以CCK-8法檢測。培養基溫育4 h后，以只加CCK-8溶液和培養液不加細胞空白孔對比，其他實驗步驟均相同。每孔的光吸光度OD值采用酶聯免疫檢測并記錄結果，其參考波長為630 nm，波長為450 nm，第2～4天后重復以上的操作。并將各組的細胞生長及影響繪制曲線圖。

1.8統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件進行t檢驗，q檢驗及單因素方差分析。

2 結 果

2.1RT-PCR檢測沉默hTERT mRNA的表達 RT-PCR檢測結果顯示，hTERT mRNA的表達在轉染組(Caski/hTERT-siRNA組)的條帶呈明顯變窄，轉染組(0.48±0.05)與未轉染組(0.82±0.10)和空白組(0.86±0.08)比較有統計學差異(P<0.05)。見圖1。

圖1 RT-PCR檢測Caski細胞中hTERT mRNA的表達

2.2Western印跡檢測沉默hTERT蛋白的表達 hTERT蛋白的表達在轉染組的條帶明顯變窄，轉染組(0.74±0.06)與未轉染組(0.92±0.09)和空白組(0.97±0.02)的灰度值有統計學差異(P<0.05,P<0.01)。見圖2。

圖2 Western印跡檢測Caski細胞中hTERT蛋白的表達

2.3細胞周期檢測結果 轉染組與未轉染組和空白組比較，G0/G1期細胞比例明顯增大，S期細胞明顯降低(均P<0.05)，G2/M期Caski細胞無統計學差異(P>0.05)，說明S期細胞受到明顯阻滯。見表1。

表1 siRNA抑制hTERT表達對Caski細胞周期的影響

與轉染組比較：1)P<0.05，下表同

2.4小室侵襲實驗檢測結果 未轉染組和空白組穿過濾膜的細胞數量分別為(45.01±0.02)%和(44.06±0.08)%；轉染組穿過濾膜的細胞數量較未轉染組與空白組明顯下降〔(25.03±0.23)%，P<0.05〕。見圖3。

2.5CCK-8增殖實驗檢測結果 與空白組和未轉染組相比，轉染組Caski細胞的增殖明顯受到抑制(P<0.05)，見表2。

圖3 各組穿過濾膜細胞(×200)

表2 hTERT siRNA對Caski細胞增殖的影響

3 討 論

臨床實踐發現，放、化療可因正常組織的可耐受性而受到限制，進而影響宮頸癌生存率的提高。目前，基因治療腫瘤是實驗研究中的一個熱點問題，國內外研究表明，新型基因作為宮頸癌的治療手段之一，為其開辟了一條新的治療方向〔11，12〕。近年來新發展的RNAi是一項沉默基因技術，siRNA的基因特異性更高。臨床研究中將建立的兩個表達HPV16 E6 siRNA的真核表達質粒以及陰性對照質粒，成功轉染到宮頸癌Caski細胞中，轉染效率能夠達到50%以上，表明轉染 E6 siRNA 質粒能使E6 mRNA 的表達明顯下降〔13〕，本研究將hTERT mRNA-siRNA克隆入pGenesil-1.1質粒中，重組成hTERT mRNA-siRNA的表達載體，通過RT-PCR檢測得知hTERT mRNA的表達降低，表明目的基因沉默，與成海恩等〔13〕的研究結果相一致。研究數據表明，端粒酶是一種反轉錄酶，能夠維持端粒長度，hTERT是端粒酶的催化亞單位〔14〕，是能以RNA為模板反轉錄合成端粒酶，hTERT與細胞生長、發育和增殖、分化有密切關聯，hTERT可以明顯抑制癌細胞生長，存在多重生物學效應〔15，16〕。hTERT表達在正常組織中是被抑制的，但在癌細胞、腫瘤系中卻呈現著高表達。研究發現hTERT基因經電轉染可以取得有效而持久的作用〔17～19〕。研究發現用電穿孔法轉染基因的目的基因瞬時表達率遠遠高于脂質體轉染方法，所以電轉染法可以作為一個有效且簡單可行的方法〔4,20,21〕。

本文顯示siRNA靶向沉默hTERT基因電轉染入宮頸癌Caski細胞后，可以對宮頸癌的治療起到積極指導作用，hTERT基因可在宮頸癌及其他腫瘤的基因治療方面提供新的靶點。

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〔2016-08-03修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

王 彥(1979-)，女，主治醫師，碩士，主要從事婦科腫瘤研究。

R737.33

A

1005-9202(2017)17-4199-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.17.013

1 天津醫科大學總醫院