鈣反應性反式激活因子在肌萎縮側索硬化癥轉基因鼠中的表達及意義

盧 強 陳燕春 劉永新 接琳琳 王巧真 杜紅梅 宋 妍 侯 琛 周風華

(濰坊醫學院病理學教研室,山東 濰坊 261053)

鈣反應性反式激活因子在肌萎縮側索硬化癥轉基因鼠中的表達及意義

盧 強 陳燕春1劉永新1接琳琳1王巧真2杜紅梅1宋 妍 侯 琛 周風華

(濰坊醫學院病理學教研室,山東 濰坊 261053)

目的探討鈣反應性反式激活因子(CREST)在肌萎縮側索硬化癥(ALS)轉基因鼠脊髓及腦干組織中的表達變化及相關性作用。方法分別取出生后95 d、108 d、122 d(早、中、晚期)野生型與SOD1-G93A轉基因鼠，通過RT-PCR、蛋白免疫印跡技術檢測脊髓組織中CREST mRNA及蛋白水平表達變化，通過免疫熒光雙標記技術檢測脊髓及腦干組織中CREST的表達變化及與神經元及星形膠質細胞的共表達情況。結果①與野生型鼠相比較，SOD1-G93A轉基因鼠脊髓組織中CREST蛋白水平下調(P<0.05)，在mRNA水平變化并不明顯。②免疫熒光雙標檢測顯示，CREST主要表達于細胞核，與神經元有共表達，與星形膠質細胞不存在共表達；與野生型鼠比較，SOD1-G93A轉基因鼠脊髓和腦干組織中CREST表達下調(P<0.05)。結論CREST的差異表達可能與ALS運動神經元的功能障礙有關。

鈣反應性反式激活因子；肌萎縮側索硬化癥

肌萎縮側索硬化癥(ALS)是一種以運動神經元進行性變性為主要病變特點的慢性神經退行性疾病，主要累及脊髓、腦干〔1〕。ALS發病與谷氨酸興奮性毒性、炎癥及細胞凋亡等多種機制有關，但具體機制目前尚未明確〔2〕。研究發現，在ALS發病過程中存在突觸結構及功能的異常，而神經元內蛋白的異常聚集會導致樹突棘密度減少而引起突觸異常，從而導致神經元功能障礙〔3〕。鈣反應性反式激活因子(CREST)是一種反式激活因子，在正常神經元樹突的生長過程中是必需的，在培養的大鼠胚胎皮層神經元中，能夠抑制樹突的生長和促進其分支發育〔4〕。本實驗擬探討CREST在ALS發病中的作用。

1 材料與方法

1.1動物及標本 野生型及突變型SOD1-G93A轉基因小鼠由美國Jackson Laboratories提供。轉基因鼠飼養、合籠及子代鼠鑒定按照吳欣等〔5〕方法進行。分別于ALS 轉基因鼠發病不同時間點(95 d，108 d，122 d)取材，以同窩野生型鼠作為對照，提取脊髓總RNA、蛋白，并制備脊髓及腦干組織冰凍切片〔6〕。

1.2主要試劑 兔抗CREST多克隆抗體 (1∶100，武漢三鷹)，雞抗β-tubulinⅢ(1∶100，R&D)多克隆抗體，雞抗膠原纖維酸性蛋白(GFAP，1∶400，Abcam)多克隆抗體，Alexa Fluor-488標記的驢抗雞IgY、Cy3標記的羊抗兔IgG(美國Jackson Immuno Research Laboratoris)，OligdT、5×逆轉錄Buffer、M-MLV逆轉錄酶(美國Promega公司)，Taq PCR Master Mix (2×)(北京天根生化科技有限公司)，TRIzol(Life Technologies)。

1.3RT-PCR TRIzol一步法提取脊髓RNA并反轉錄合成cDNA〔5〕。以β-actin為內參，反應體系： 2×PCR mix 10 μl，CREST上下游引物各1 μl，β-actin上下游引物各0.6 μl，cDNA 1 μl，滅菌雙蒸水補齊至20 μl，循環條件：開始94℃ 3 min，然后94℃ 30 s，57℃30 s和72℃30 s，共30個循環，最后72℃5 min，冷卻至4℃備用，瓊脂糖凝膠電泳并拍照。CREST上游引物：5′CCACCTCCATGAGCATCTCT3′，下游引物：5′TGGTCCGAGACACGTAGTTG3′ (擴增片段長度108 bp)；β-actin上游引物：5′ CGTTGACATCCGTAAAGACC3′，下游引物：5′ ACAGTCCGCCTAGAAGCAC 3′ (擴增片段長度280 bp)。

1.4免疫印跡〔6〕應用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)分離蛋白樣品，按120 μg蛋白/每孔上樣。兔抗CREST抗體(1∶1 000)和小鼠抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體(1∶2 000)，4℃孵育過夜；HRP標記的相應二抗常溫孵育2 h。化學增強發光法(ECL)化學發光，暗室曝光。

1.5免疫熒光雙標記〔6〕將處理好的脊髓及腦干組織制備冰凍切片，厚10 μm，室溫下晾干后行免疫熒光雙標記染色。一抗為兔抗CREST抗體(1∶100)分別與雞抗β-tubulinⅢ(1∶100)及雞抗GFAP(1∶400)混合液。

1.6統計學方法 采用圖像分析軟件IPP5.1檢測圖片累積光密度及陽性細胞IOD值。使用SPSS20.0軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1CREST蛋白及mRNA水平在脊髓組織中的表達變化 蛋白免疫印跡結果顯示，與同一時間點野生型鼠(95 d：2.48±0.098，108 d：2.63±0.085,122 d:2.51±0.072)相比，ALS鼠脊髓組織中CREST在蛋白水平表達下調(95 d:1.32±0.081,108 d:1.34±0.045,122 d:1.25±0.070;P<0.05)。RT-PCR結果顯示，與同一時間點野生型鼠(95 d：0.49±0.046，108 d:0.47±0.045,122 d:0.50±0.050)相比，ALS鼠脊髓組織中CREST mRNA水平變化并不明顯(95 d:0.46±0.010,108 d:0.48±0.036,122 d:0.46±0.053;P>0.05)。見圖1。

2.2CREST免疫熒光雙標記檢測 見圖2。CREST主要表達于細胞核。在脊髓組織中，CREST陽性細胞位于脊髓灰質，尤其見于退行性變較明顯的脊髓前角；在腦干組織中多個部位均可查見陽性細胞，在舌下神經核、面神經核以及紅核(RMC)有差異表達，在脊髓及腦干各部位，CREST均與神經元有共表達，與星形膠質細胞不存在共表達。與野生型鼠比較，ALS鼠中CREST表達下調(P<0.05)。

GM：脊髓前角，7N：面神經核，12N：舌下神經核，標尺=20 μm圖2 CREST與β-tubulinⅢ在ALS轉基因鼠122 d脊髓前角及腦干神經核團的免疫熒光雙標記

3 討 論

ALS是一種致死性的慢性神經退行性疾病，由于大腦皮層、腦干及脊髓運動神經元的變性導致了進行性肌肉麻痹〔7〕，在ALS發病中腦干的舌下神經核、面神經核及RMC的退變明顯，主要癥狀表現為吞咽困難和構音障礙，脊髓發病型由脊髓前角的運動神經元變性引起，主要癥狀表現為肢體肌肉的進行性麻痹。CREST是一種SYT相關核蛋白〔8〕，結構上包括3個功能域：①C-末端的轉錄活性域介導鈣誘導的反式激活〔9〕；②N-末端能夠抑制基礎狀態的轉錄活性；③中間是富含甲硫氨酸的一個多功能結構域，與蛋白質的二聚化、轉錄活性的調節以及蛋白的亞細胞定位有關〔10〕。 研究發現，CREST對于神經系統的發育是非常重要的，對于維持正常神經元樹突的生長過程是必需的，在培養的大鼠胚胎皮層神經元中，能夠抑制樹突的生長和促進其分支的發育〔4〕，缺乏CREST的小鼠神經元樹突的生長和分枝明顯減少，并且大多數小鼠出生后會死亡〔8〕。本文發現ALS鼠CREST蛋白水平表達下調，提示CREST蛋白與ALS的發生發展有一定關系，并且CREST的異常表達可能與神經元的功能異常有關。

1Lemarchant S，Pomeshchik Y，Kidin I，etal.ADAMTS-4 promotes neurodegeneration in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis〔J〕.Mol Neurodegener，2016;11(1)：10.

2Nanou A，Higginbottom A，Valori CF，etal.Viral delivery of antioxidant genes as a therapeutic strategy in experimental models of amyotrophic lateral sclerosis〔J〕.Mol Ther，2013;21(8)：1486-96.

3Gorrie GH，Fecto F，Radzicki D，etal.Dendritic spinopathy in transgenic mice expressing ALS/dementia-linked mutant UBQLN2〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，2014;111(40)：14524-9.

4Pradhan A，Liu Y.A multifunctional domain of the calcium-responsive transactivator (CREST)that inhibits dendritic growth in cultured neurons〔J〕.J Biol Chem，2005;280(26)：24738-43.

5吳 欣，管英俊，于 麗，等.Wnt抑制因子-1在肌萎縮脊髓側索硬化癥轉基因小鼠中的表達變化〔J〕，解剖學報，2011;42(5)：588-93.

6陳燕春，劉煥彩，管英俊，等.Akt在肌萎縮性脊髓側索硬化癥轉基因鼠脊髓中的表達變化及意義〔J〕.解剖學雜志，2014；30(3)：331-4.

7Al-Chalabi A，Jones A，Troakes C，etal.The genetics and neuropathology of amyotrophic lateral sclerosis〔J〕.Acta Neuropathol，2012；124(3)：339-52.

8Aizawa H，Hu SC，Bobb K，etal.Dendrite development regulated by CREST，a calcium-regulated transcriptional activator〔J〕.Science，2004；303(5655)：197-202.

9Valero T，Moschopoulou G，Kintzios S，etal.Studies on neuronal differentiation and signalling processes with a novel impedimetric biosensor〔J〕.Biosens Bioelectron，2010；26(14)：1407-13.

10Iukharsky MS,Quintiero A,Matsumoto T,etal.Calcium-responsive transactivator (CREST)protein shares a set of structural and functional traits with other proteins associated with amyotrophic lateral sclerosis〔J〕.Mol Neurodegener，2015；10(1)：20.

〔2016-02-15修回〕

(編輯 袁左鳴)

Expressionofcalcium-responsivetransactivatorinALStransgenicmice

LUQiang,CHENYan-Chun,LIUYong-Xin,etal.

DepartmentofPathology,WeifangMedicalUniversity,Weifang261053,Shandong,China

ObjectiveTo investigate the expression of calcium-responsive transactivator (CREST) in the spinal cord and brainstem of ALS transgenic mice,and explore the role and significance of CREST in the pathogenesis of ALS.MethodsThe mRNA and protein level of CREST were detected by RT-PCR and Western blot in the spinal cord of ALS transgenic mice at the different stages of disease (post-natal 95 d,108 d and 122 d). The immunofluorescence was used to detect the coexpression of CREST/β-tubulinIII and CREST/GFAP in the spinal cord and brain stem.ResultsCompared with that of wild type mice,the protein level of CREST in the spinal cord tissue was down-regulated (P<0.05),but not significant at mRNA level. CREST was mainly expressed in the nucleus. CREST-positive cells were also β-tubulinIII positive but GFAP negative. Compared with that of wild-type mice,CREST level of SOD1-G93A transgenic mice in the spinal cord and brain stem was down-regulated (P<0.05).ConclusionsThe differential expression of CREST may be related to the dysfunction of motor neurons in ALS.

Calcium-responsive transactivator; ALS

國家自然科學基金青年基金(81271413，81401066)；山東省科技發展計劃項目(2012GSF11827)；山東省自然科學基金(ZR2012HQ021)；山東省教育廳課題(J12LK51，J13LK05)；山東省醫藥衛生科技發展計劃項目(2013WS0279)

周風華(1977-)，女，副教授，碩士，主要從事神經發育與神經退行性疾病相關研究。

盧 強(1988-)，男，在讀碩士，主要從事神經發育與神經退行性疾病相關研究。

R744.8

A

1005-9202(2017)17-4177-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.17.004

1 濰坊醫學院組織學與胚胎學教研室

2 濰坊醫學院人體解剖學教研室