兔腦缺血后自噬激活與ROCK-JNK信號通路的關系

王子珍 鄭傳宜 楊 堃

(海南醫學院第一附屬醫院神經外科，海南 海口 570100)

兔腦缺血后自噬激活與ROCK-JNK信號通路的關系

王子珍 鄭傳宜 楊 堃

(海南醫學院第一附屬醫院神經外科，海南 海口 570100)

目的探討腦缺血后神經元自噬激活與Rho蛋白激酶(ROCK)-C-Jun氨基酸末端激酶(JNK)信號通路的關系。方法建立蛛網膜下腔出血(SAH)后腦缺血兔腦模型，檢測腦組織梗死面積確定模型是否成功。在二次注血后的不同時間處死模型，取腦缺血區域腦組織，行Western印跡檢測腦組織中神經元細胞壞死、凋亡和自噬現象。通過Western印跡檢測自噬抗體蛋白在兔腦模型中的表達情況。免疫組化檢測腦缺血區域的自噬蛋白和ROCK-JNK信號通路蛋白的表達情況。結果采用 Longa 線栓法建立 SAH 模型成功率較高。兔腦組織中存在神經元細胞壞死、凋亡和自噬現象，模型組腦組織梗死面積相比對照組增多。Western印跡及免疫組化證實遲發型血管痙攣與神經元細胞自噬存在關聯。結論腦缺血后的腦組織中存在神經元自噬現象且和ROCK-JNK信號通路存在一定關系。

腦缺血；ROCK；JNK；自噬

腦缺血后最常見也是最嚴重的并發癥就是遲發型腦血管痙攣(DCVS)，其中約 30%可發生延遲性腦缺血神經功能障礙〔1～3〕。有研究表明，DCVS后可以激活神經元細胞自噬，通過電鏡發現，在大腦皮層的神經元細胞中有自噬-溶酶體的激活〔4〕，在蛋白分子水平上也可以檢測到自噬相關蛋白的表達，其中ATG5/LC3是目前公認的重要的自噬體標志物〔5〕。Beclin-1也是哺乳動物發生自噬過程中不可或缺的組分。因此，通過檢測幾種自噬蛋白標志物的表達可以有效表明自噬過程的存在。Rho蛋白激酶(ROCK)是絲氨酸蛋白激酶家族成員，為Rho/ROCK信號通路中的重要轉導因子，也是Rho下游功能機制研究比較清楚的效應因子之一〔6〕。有研究表明Rho/ROCK信號通路可以激活C-Jun氨基酸末端激酶(JNK)的信號通路，通過激活JNK通路中的小分子GTP酶，經過信號轉導調節C-jun的表達，進而調控細胞自噬功能〔7～10〕。本研究通過檢測自噬蛋白和ROCK/JNK信號轉導通路的蛋白表達水平，探討DCVS后的自噬激活與ROCK/JNK信號通路的關系。

1 材料和方法

1.1兔缺血再灌注模型制作 兔購于河南醫學院實驗動物中心，共180只，體重2.5～3.0 kg，4～5月齡，在清潔安靜的環境下飼養。采用 Longa線栓法制作缺血再灌注模型，兔腦缺血2 h后恢復再灌注。判定采用 Longa 5級標準評分法神經功能缺損評分：0分：正常，未見任何神經功能缺損的表現；1分：垂直提起時病灶對側肢體不能伸直；2分：行走時身體向病灶對側傾斜或旋轉；3分：行走時身體向病灶對側跌倒；4分：出現意識障礙或不能自發行走。評分為 0 分或 4 分、不明原因或明確原因提前死亡、術中出血過多、生命體征不穩定及處死時發現存在蛛網膜下腔出血(SAH)的兔模型不予采納并隨時補充。未行處理的納入對照組。

1.2石蠟包埋及免疫組化 常規石蠟包埋兔腦組織，組織切片厚5 μm。免疫組化步驟按免疫組化S-P試劑盒(北京博奧森生物技術有限公司)說明書操作：載玻片脫蠟、水化，然后在枸櫞酸鹽緩沖液(pH6.0；Sigma)中運用微波爐抗原修復20 min，自然冷卻至室溫。PBS洗3次3 min，3%H2O2室溫孵育15 min，PBS洗3次3 min，5%羊血清(ab7475，Abcam Company)37℃水浴30 min，一抗體(1∶100，ab14513,Abcam Company)，37℃水浴2 h，PBS洗3次3 min，辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG(1∶300，北京博奧森生物技術有限公司)，PBS洗3次3 min，辣根酶標記鏈酶卵白素工作液(北京博奧森生物技術有限公司)37℃水浴30 min，PBS洗3 min×3次，二氨基聯苯胺(DAB)顯色。陰性對照用PBS代替一抗。

1.3Western印跡 裂解組織以每孔25 μg上樣后行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉移至PVDF膜，依次加入:LC3和Beclin1單克隆抗體(稀釋度1∶5 000和1∶2 000)和辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG，化學熒光發光法(ECL)顯影(碧云天公司)，操作過程按說明書進行。用凝膠成像系統成像對結果進行灰度掃描分析，相對表達量以相應灰度面積積分與內參的比值計算。

1.4免疫組織化學 取與痙攣血管相應的供血區兔腦組織，利用SP試劑盒行免疫組化染色，并在共聚焦顯微鏡下觀察。選用的抗體包括ROCK、JNK、LC3及Beclin1。各組選擇頂葉缺血區周圍皮質作為觀察部位，在高倍鏡(×400)下隨機取 3 個不重疊的視野拍照，利用 Image-pro plus6.0 圖像分析軟件分析每個視野 ROCK、JNK、LC3、Beclin1的平均光密度值。

1.5統計學方法 采用SPSS13.0行單因素方差分析，方差不齊者用Karuskal-wallis方法處理。

2 結 果

2.1兔腦缺血再灌注模型神經功能缺損評估 90只成功造模的模型兔神經功能評分：1 分 45 只，2 分 31 只，3 分 14只。行為觀測：對照組一般生活情況佳，未出現明顯神經功能紊亂癥狀；模型組栓塞動脈后2 h神經功能評價出現明顯差別，一般生活情況差，精神不振、反應遲鈍、食欲不佳等，神經缺損癥狀與體征明顯。見表1。

2.2腦缺血側皮質區梗死體積 模型組可觀察到大腦皮層下出現大片梗死灶，呈白色，對照組梗死灶面積〔(11.65±1.67)%〕與模型組〔(29.37±2.89%)〕比較明顯減少(P<0.05)。

2.3大腦缺血半球皮層自噬標志蛋白 LC3 和 Beclin-1 水平的

變化 對照組兔大腦缺血半球皮層 LC3的表達水平較低(0.130±0.044)。模型組兔腦缺血半球皮層 LC3 蛋白表達量明顯增加(P<0.01)。Beclin-1 蛋白表達水平趨勢與LC3相同，對照組表達水平較低(0.187±0.021)，模型組蛋白水平明顯升高(P<0.05)。見圖1。

2.4大腦缺血半球皮層ROCK-JNK自噬激活情況 ROCK在各組雖然有不同程度表達，但表達總體水平較低。模型組蛋白表達水平比對照組明顯增高(P<0.05)，JNK在模型組的表達明顯高于對照組(P<0.05)。LC3和Beclin-1蛋白在模型組腦組織中的表達顯著高于對照組(P<0.05)。見圖2。

表1 各組神經功能評分

與對照組比較：1)P<0.05

圖1 兔大腦缺血半球皮層LC3 和 Beclin-1 水平的變化

圖2 免疫組化法顯示各組大腦缺血半球皮層ROCK-JNK自噬的激活情況(×400)

3 討 論

有研究表明，Rho可以通過ROCK直接激活JNK，調控c-Jun的表達，但是這種調控不單單是依靠ROCK的聚合解聚作用，而是通過靶向因子的信號傳導〔11～13〕。在乙二醇誘導星形細胞自噬的過程中，發現抑制Rho小分子GTP酶和ROCK激酶后，自噬細胞的肌動蛋白和肌球蛋白磷酸化后引發收縮〔14〕。因此我們考慮ROCK的激活可以調控自噬細胞的形態學變化，可以引起細胞膜發泡，進而促進巨噬細胞識別并介導自噬的發生。

在大部分真核生物體內，JNK通路是MAPKs信號通路的一種，主要介導細胞的凋亡、增殖、分化等一系列的生物學行為，而且在神經元細胞中都有表達〔15〕。有研究證明，JNK信號通路和大腦缺血再灌注之間有密切的關聯〔16〕。近年來，不斷有學者報道指出，JNK3和神經元細胞的自噬凋亡有一定聯系，在腦卒中靶向治療中是一個潛在有效靶點〔17〕。有研究表明，JNK的激活可以對神經元造成不可逆的損傷，在損傷30～60 min后癥狀最明顯，且應用抑制劑可以減少其損傷程度〔18〕；而ROCK可以在自噬過程中激活JNK，加重神經元的再灌注損傷。

本實驗結果表明，腦缺血后神經元細胞存在自噬現象，可能是通過ROCK-JNK雙向調控激活自噬的發生。

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〔2017-02-16修回〕

(編輯 郭 菁)

TherelationshipbetweencerebralischemiaautophagyactivationwithROCK-JNKsignalingpathway

WANGZi-Zhen,ZHENGChuan-Yi,YANGKun.

DepartmentofNeurosurgery,theFirstAffiliatedHospitalofHannanMedicalCollege,Haikou570100,Hainan,China

ObjectiveTo explore the relationship between cerebral ischemia autophagy activation with ROCK-JNK signaling pathway.MethodsThe subarachnoid hemorrhage cerebral ischemic rabbit brain models were induced to test the extent of brain tissue. After double injection at different times, the rabbits were sacrificed, and brain ischemic area of brain tissue were detected by Western blot.The expressions of ROCK-JNK signaling pathway proteins were detected by immunohistochemical method.ResultsNeuronal cell necrosis, apoptosis and autophagy phenomenon were observed in rabbit brain tissues. Western blot and immunohistochemistry confirmed the association between late onset vasospasm and neuronal autophagy.ConclusionsThe neurons autophagy exists in the brain tissue after ischemia, and ROCK-JNK signaling pathway is a certain relationship with autophagy.

Cerebral ischemia; ROCK; JNK; Autophagy

國家自然科學基金(81260371)；海南省自然科學基金項目(20158300)

王子珍(1966-)，男，副主任醫師，主要從事腦腫瘤及腦血管病的診斷與治療研究。

R743.31

A

1005-9202(2017)17-4173-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.17.002