高效液相色譜法測定云南小粒咖啡豆中咖啡因的含量

陳嫻+刁玉華+肖麗恒

摘 要：建立測定云南小粒咖啡豆中咖啡因含量的HPLC方法，采用高效液相色譜儀帶紫外檢測器，使用C18柱（粒徑：5 μm，3.9 mm×150 mm）；流動相：甲醇+水（24+76）；流速：1.0 mL/min；紫外檢測器：檢測器波長272 nm；柱溫：25 ℃；進樣量10 μL作為分析條件。咖啡因在0～200 ug/mL范圍內線性關系良好，相關系數均大于0.999；回收率均在90%～110%之間；檢出限為0.125 mg/kg。結論 該法具有準確、靈敏、重復性好等優點，適合飲料中的咖啡因含量的檢測。

關鍵詞：液相色譜法 測定 云南小粒咖啡豆 咖啡因

中圖分類號：O652.1 文獻標識碼：A 文章編號：1674-098X（2017）07（a）-0126-02

咖啡因：（Caffeine）是咖啡果中含有的一種生物堿，適度使用有祛除疲勞、興奮神經的作用，臨床上用于治療神經衰弱和昏迷復蘇。但是，大劑量或長期使用也會對人體造成損害，特別是它也有成癮性，一旦停用會出現精神萎頓、渾身困乏疲軟等各種戒斷癥狀，雖然其成癮性較弱，戒斷癥狀也不十分嚴重，但由于藥物的耐受性而導致用藥量不斷增加時，咖啡因就不僅作用于大腦皮層，還能直接興奮延髓，引起陣發性驚厥和骨骼震顫，損害肝、胃、腎等重要內臟器官，誘發呼吸道炎癥、婦女乳腺瘤等疾病，甚至導致吸食者下一代智能低下，肢體畸形。因此也被列入受國家管制的精神藥品范圍。濫用咖啡因通常也有吸食和注射兩種形式，其興奮刺激作用及毒副反應、癥狀、藥物依賴性與苯丙胺相近。咖啡因主要用于對抗中樞抑制狀態，如嚴重傳染病、鎮靜催眠藥過量引起的昏睡及呼吸循環抑制等，可肌肉注射苯甲酸鈉咖啡因。此外，咖啡因還常配伍麥角胺治療偏頭痛：配伍解熱鎮痛藥治療一般性頭痛[1]。此時，它由于收縮腦血管，減少腦血管搏動的幅度而加強以上藥物止頭痛的作用。目前對于咖啡因測定的方法主要有：滴定法[2]、紫外可見分光光度計法[3]、高效液相色譜法[4]、氣相色譜法[5]、薄層色譜法[6]、毛細管電泳法[7]等方法。文章采用高效液相色譜的方法測定咖啡因，建立了采用高效液相色譜的方法測定云南小粒咖啡豆中咖啡因的方法，試驗表明該方法前處理簡單，分離效能好，回收率高，可以快速、簡便、準確地檢測云南小粒咖啡豆中的咖啡因，得到準確的檢測結果。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

云南小粒咖啡豆（市售）；超純水；氧化鎂（MgO）；甲醇（CH3OH）：色譜純；咖啡因標準品（C8H10N4O2）：純度≥99%；編號：58-08-2；批號：200911；生產廠家：美國。

高效液相色譜儀（帶紫外檢測器，Agilent 1260美國安捷倫科技有限公司）；水浴鍋（HH-6常州國華有限公司）；電子天平（CP213美國，奧豪斯），感量為0.1 mg；超純水器（明澈UV24美國密理博公司）。

1.2 試驗方法

稱取1 g（精確至0.001 g）經粉碎低于30目的均勻樣品于250 mL錐形瓶中，加入約200 mL水，沸水浴30 min，不時振搖，取出流水冷卻1 min，加入5 g氧化鎂，振搖，再放入沸水浴20 min，取出錐形瓶，冷卻至室溫，轉移至250 mL容量瓶中，加水定容至刻度（使樣品溶液中咖啡因含量在標準曲線范圍內），搖勻，靜置，取上清液經微孔濾膜過濾，備用。

1.2.1 標準曲線的繪制

咖啡因標準儲備液（2.0 mg/mL）：準確稱取咖啡因標準品0.002008 g（精確至0.1 mg）于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容。放置于4 ℃冰箱，有效期為6個月。

咖啡因標準中間液（200 μg/mL）：準確吸取5.0 mL咖啡因標準儲備液于50 mL容量瓶中，用水定容。放置于4 ℃冰箱，有效期為一個月。咖啡因校準曲線工作液：吸取咖啡因標準中間液，配制成濃度分別為10.0、20.0、40.0、80.0、100、120.0、160.0、200 μg/mL的工作液，臨用時配制。將標準系列工作液經液相色譜儀測定，以標準工作液的濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.2 儀器工作條件

色譜柱：C18柱（粒徑：5 μm，3.9 mm×150 mm）；流動相：甲醇+水（24+76）；流速：1.0 mL/min；紫外檢測器：檢測器波長272 nm；柱溫：25 ℃；進樣量10 μL。

2 結果與分析

2.1 校準曲線

取咖啡因標準溶液，用高效液相色譜儀自動進樣，標準曲線方程為y=27.32252x+12.55479，r=0.99985（見表1），表明線性關系良好。

2.2 精密度試驗

取咖啡因含量高、中、低3個濃度分別進行6次測定，計算6次結果的相對標準偏差，變異系數均小于15%（見表2），表明使用該方法測定咖啡因數據可靠。

2.3 檢出限

方法的測定限為信噪比（S/N）3∶1時的濃度，計算得到方法檢出限為：0.000 5 μg/mL，即：0.125 mg/kg。

定量限為信噪比（S/N）10∶1時的濃度為：0.42 mg/kg。標樣色譜圖如圖1，樣品色譜圖。

2.4 回收率和誤差

精確稱取1.0 g云南小粒咖啡豆樣品，加入標樣，濃度為20.28 μg/mL，進行3次測定，經測定后平均值117.634 4 mg/kg，誤差為3.6，回收率為97%（見表3）。偏差范圍小，說明該方法的準確度較好。

3 結語

試驗結果表明，采用建立的高效液相色譜檢測方法測定云南小粒咖啡豆中的咖啡因，具有準確、快速、簡便的優點，且測量的范圍滿足標準限量的檢測要求。

參考文獻

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[2] 張帆，賀學峰，汪學楷.高效液相色譜法測定飲料中食品添加劑的含量[J].四川大學學報：工程科學版，2000，34 （4）：56-58.

[3] 沈其元.高效液相色譜法測定飲料中的咖啡因[J].環境與職業醫學，2002，19（5）：329.

[4] 趙清嵐，楊靜，白冰，等.薄層掃描法同時測定綠茶中的EGCG、ECG和咖啡因[J].河南大學學報：自然科學版，2009，39（3）：256-258.

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