淺談分子生物學在土壤微生物多樣性研究中的應用

吳麗莉

摘要：傳統的土壤微生物分離培養、鑒定技術難以深入了解微生物的生態學特性和多樣性，而分子生物學方法可以獲取更加豐富的土壤微生物群落多樣性信息，包括傳統方法無法培養的土壤微生物。本文就目前土壤微生物的多樣性研究中使用的分子生物學技術進行探討研究，并對各個分子生物學實驗技術的特點做了比較分析。

關鍵詞：土壤微生物；生物多樣性；分子生物學；DNA

一、土壤微生物多樣性的定義

土壤微生物的多樣性體現在生物體在遺傳、種類和生態系統層次上的差異和變化，也反映了土壤生態機制對微生物群落的影響。土壤微生物多樣性還可以理解為豐富的微生物生命。一般由土壤生物區的變化和生物化學過程間的關系來體現。

二、土壤微生物多樣性研究中運用的分子生物學技術

（一）土壤微生物DNA復性動力學分析

實驗表明，可以通過測定微生物群落DNA的復性率和解鏈行為來確定土壤微生物群落的大體成分和整體遺傳多樣性。微生物多樣性的復雜程度隨著DNA的同源性變化，DNA同源性越差，多樣性越復雜，DNA的復性率就越低。在受不同程度重金屬污染的土壤中微生物多樣性的變化中這種方法被Sandaa等所采用。沒有受到污染的對照土壤通過該技術分析顯示含有32 000個細菌基因組，而這個數字在受重金屬污染程度較輕的土壤是1 2800，在受嚴重重金屬污染的土壤是4000個，相比未受污染的土壤中的細菌基因組分別減少了60%和90%。由數據可知，土壤受到污染越嚴重，土壤微生物多樣性越低。但這個技術有明顯的缺點，即分辨率不高，僅僅用這個技術來分析只能知道土壤微生物群落的大體情況，并不能精確表示微生物多樣性的變化情況。因此在實際研究中，還需要結合核酸雜交等更好的技術才能得到更精確的結果。

（二）核酸分子雜交技術

20世紀70年代出現了分子生物學技術——核酸分子雜交技術。這種技術的原理是根據核酸分子堿基互補配對的原則，將待測微生物的DNA或RNA與特異性探針進行雜交形成新的分子。核酸分子雜交技術由于其特異性靈敏性高的優點，在近年的微生物多樣性研究中被廣泛應用。其中最為常用的的手段是近年來發展起來的熒光原位雜交技術。它可以鑒定細胞形態和微生物種群結構，進行樣品的原位雜交，也可用于測定細胞活性和計數。該技術根據已知微生物的不同類別種群特殊的DNS序列用熒光標記的特殊寡聚核苷酸片段作為探針，與待測微生物的DN分子雜交，以測定該微生物群落多樣性的豐度。研究結果也顯示，土壤微生物的多樣性隨土壤受污染程度的升高而下降，但是熒光原位雜交技術（FISH）對于土壤樣品的靈敏度較低。

（三）基于PCR的分子生物學研究技術

PCR技術的出現和運用使土壤微生物生態學研究獲得飛躍發展。由于土壤微生物群落的16S rRNA、18S rDNA 或ITS 區域目標基因含有高度保守序列、多拷貝序列和高度可變序列，因而其基因結構相對穩定，利于設計特異性引物，現已成為細菌分類學研究中最常用最有效的分子鐘。此外，真菌ITS的分析也越來越受到重視，因為其序列中包含保守和可變信息。可以借助用特異性或通用引物在直接提取和純化土壤微生物樣品的總DNA后擴增目標片段，然后分期目標片段。基于PCR的分子生物學技術有以下幾種。

1. 變性梯度凝膠電泳和溫度梯度凝膠電泳（DGGE/TGGE）。該技術的原理是對DNS雙鏈分子使用化學變性劑或溫度對其進行處理，以分離序列不同但長度相同的DNA片段。可以根據條帶的位置和電泳條帶的數量大致確定土壤中的微生物種類，對土壤中的微生物的多樣性進行粗略分析。此方法有很高的靈敏度，通過成像系統分析染色后的凝膠，切下目標帶進行擴增或測序可以獲取更完整的信息。除此之外DGGE/TGGE技術因為能同時測定多個土壤樣品的微生物群落構成和變化情況，具有可重復性、快速等特點，所以被廣泛應用在土壤微生物的多樣性研究等方面。其缺點是，目前還不能檢測到所有的微生物多樣性，特變是難以檢測到劣勢微生物種群。

2.單鏈構象多態性（SSCP）。SSCP方法的原理是，單鏈DNA的構象會隨著堿基的變化而變化，而具有不同空間構象的單鏈DNA分子在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中的帶型也不同，以此精確地區分二級結構不同但大小一樣的PCR產物。在研究高溫堆肥微生物群落、根系微生物、受污染的土壤微生物生態多樣性方面SSCP方法已經被成功應用。比如通過該方法分析根系微生物，已準確地檢測到微生物群落的動態變化，SSCP方法比傳統培養更加省時省力，避免了誤差大的干擾，在對微生物群落結構和演替的分析中非常適用。

3.限制性片段長度多態性（RFLP）/擴增核糖體DNA限制性分析（ARDRA）。限制性片段長度多態性（RFLP）另一個名稱是擴增核糖體DNA限制性分析（ARDRA），該技術通過通用引物擴增DNA目標片段（如：16S rDNA），然后將其克隆轉移至大腸桿菌中，將陽性克隆篩選出來，建立16S rDNA克隆文庫。然后用帶有目標基因的克隆細胞作為PCR模板，利用限制性內切酶對PCR擴增產物進行酶切，進過電泳之后，可對酶切片段進行限制性多態性分析。該技術的特點是能對微生物種群的目標DNA構成進行直接研究，而且限制性內切酶識別序列專一性使得RFLP技術就有較高的可靠性。此外，該技術涉及較多的遺傳信息，因此具有較強的區分種群差異的能力。

4.末端限制片段長度多態性（T-RFLP）。T-RFLP是在RFLP方法的基礎上加以改良，在PCR擴增16S rRNA基因過程中，使用熒光標記一個引物用，而且僅僅分析被標記的末端限制片段，以此簡化多態性圖譜，使得每個可見的條帶都代表一個“核型”或一個分類單元，最后得到一個微生物群落的特征指紋圖譜。可用于比較不同群落的相似性和檢測污染造成的群落結構在時空上的變化。

5.隨機引物擴增多態性方法（RAPD）。RAPD方法在非嚴格條件下運用短的任意序列引物進行PCR，使得可以同時擴增基因組的多個位點，讓后將PCR產物進行凝膠電泳分析。該方法可以同時在一次試驗中觀測到大量DNA多態性片段，方法簡單，靈敏度高，成本較低。例如運用RAPD方法分析四種受到農業污染的土壤微生物的多樣性，發現土壤中的微生物數量因為使用殺蟲劑而降低。但是多樣性依然較高，而用過化肥的土壤中的微生物數量很高，但多樣性卻下降了。endprint

6.擴增片段長度多態性（AFLP）。擴增片段長度多態性是基于PCR和RFLP的一種DNA指紋技術。該技術結合PCR的高效性和RFLP的可靠性，選擇性擴增基因組對基因組DNA酶切片段，通過切割兩種以上的酶形成有不同酶切位點的限制酶切片段，然后在片段上增加雙鏈人工接頭，AFLP修飾了PCR的引物，結合引物與酶切片段識別序列，其核心序列與人工接頭互補，從而實現了選擇性擴增。該技術能有效地呈現微生物多樣性程度，AFLP標記理論上數目是無限的，其重復性較好。

7.核糖體間隔序列分析（RISA）/自動核糖體間隔序列分析（ARISA）。RISA和ARISA是一種分子指紋技術，基于核糖體分析土壤微生物。它也是利用PCR技術對細菌高度可變序列IGS區域進行擴增，再利用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳使其變性和分離，從而獲取各種微生物指紋信息。ARISA不同于RISA，其正向引物用熒光標記，且自動完成測試。其靈敏性高、可重復，比RISA方法更加省時高效，不要的DNA樣品也更少。目前ARISA法被廣泛應用于檢測土壤微生物多樣性、測定污染土壤的微生物多樣性、微生物群落結構的檢測等方面。

三、結束語

綜上所述，這些技術都可以運用在土壤微生物多樣性的檢測上，每種方法都有各自的優缺點，都存在局限性。而當前最合理的方式是綜合運用多種方法研究土壤微生物多樣性，以獲取盡量完整的信息。此外，我們有必要繼續探索更新的研究技術，如果能找到更好的方法來研究土壤微生物多樣性，那么我們就能更加清晰準確地解土壤微生物的種類和及其和環境之間的關系。現代分子生物學技術給我們的研究提供了更多的可能，幫助我們打開了土壤微生物世界的大門。筆者相信，有機結合現代分子生物技術與其他方法，一定能幫助我們更好地認識研究土壤微生物多樣性。

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