MMP-7在胃癌中表達上調的臨床病理意義及預后價值

沈小鋼，郭志義，趙高平，王 林

(四川省醫學科學院·四川省人民醫院胃腸外科，四川 成都 610072)

MMP-7在胃癌中表達上調的臨床病理意義及預后價值

沈小鋼，郭志義，趙高平，王 林

(四川省醫學科學院·四川省人民醫院胃腸外科，四川 成都 610072)

目的探討基質金屬蛋白酶-7(MMP-7)的表達與胃癌臨床病理特征的關系以及對胃癌患者預后判斷的價值。方法采用實時熒光定量PCR技術檢測112例胃癌患者的癌組織和癌旁正常組織中MMP-7的表達。比較不同MMP-7表達水平胃癌患者的臨床病理學特征，以及患者的生存分析。結果MMP-7在胃癌組織中相對于正常胃黏膜組織高表達(P= 0.001)。胃癌患者MMP-7表達上調，有更高的病理學分期(P= 0.037)，更深的組織浸潤深度(P= 0.028)，淋巴結轉移(P= 0.015)和脈管浸潤(P= 0.042)，以及更差的總體生存率(P= 0.008)和無病生存率(P= 0.015)。結論MMP-7在胃癌患者中高表達并預示著更差的術后生存率。

基質金屬蛋白酶-7；胃癌；轉移；預后

全球每年新發胃癌951600例并導致723100例死亡[1]。盡管手術技術不斷提高化療藥物不斷發展，我國胃癌患者的五年生存率依然低于40%。基因的易感性以及環境因素共同導致了腫瘤的發生已獲得了廣泛的共識。研究胃癌的侵襲和轉移對早期診斷胃癌，提高胃癌患者的預后具有重要意義。基質金屬蛋白酶(MMPs)是一類分泌蛋白水解酶，該蛋白酶能降解細胞外基質，對血管生成、組織修復以及腫瘤浸潤都有十分重要的作用[2]。基質金屬蛋白酶-7(MMP-7)又稱基質溶素，已有研究發現MMP-7蛋白在胃癌中高表達[3]。但目前對胃癌中MMP-7的mRNA表達水平知之甚少，更是缺乏其表達與胃癌患者預后關系的研究。本研究擬通過實時熒光定量PCR技術，研究MMP-7在胃癌及癌旁正常組織中的表達變化，分析不同表達水平胃癌患者的臨床病理學特征，以及不同的生存率，為胃癌的臨床診斷及治療提供依據。

1 資料與方法

1.1一般資料2011年7～12月在四川省人民醫院胃腸外科中心行胃癌根治術的患者112例，術前未接受放療或化療，術后給予常規化療。癌旁正常組織取材于距離腫瘤邊緣至少5厘米的胃正常黏膜組織。所有胃癌及胃正常黏膜組織均在標本離體后第一時間采集并立即存放于液氮罐，最終存放于-80 ℃冰箱。術后依據國際抗癌聯盟第7版TNM分期對病員進行病理分期。患者的隨訪在術后的前兩年每3個月1次，之后每半年1次，包含體格檢查，腫瘤標志物檢查，CT和胃鏡檢查。懷疑復發則通過活檢進一步診斷。總生存期定義為手術日至患者死亡的時間，無病生存期定義為手術日至癌癥復發或患者死亡的時間。該研究符合四川省醫學科學院·四川省人民醫院醫學倫理委員會所制定的倫理學標準并通過該委員會批準，所有受試對象術前均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1引物序列與合成 本實驗選取GADPH作為內參基因，利用Taqman Gene Expression Assays軟件設計針對MMP-7和GADPH的特異性引物和探針由中國大連的Takara生物公司合成，如表1所示，并通過NCBI提供的BLAST程序驗證了核酸序列的特異性。

表1 MMP-7與GADPH的引物及探針序列

1.2.2熒光定量PCR檢測 使用美國Invitrogen公司的Trizol試劑按照說明書的方法提取總RNA，用紫外分光光度計測量260和280 nm下的吸光度并進行定量，計算D(260)/D(280)，所有標本的比值要求在1.8～2.0之間。低于此值者表明其含有雜質，用氯仿重新提純。利用美國Fermentas公司的第一鏈合成試劑盒將2μg的RNA逆轉錄生成cDNA。基于Taqman探針技術的實時熒光定量PCR技術被用于基因表達的相對定量檢測。該實驗在美國BIO-RAD公司的iCycler iQ系統上完成。所用的反應條件如下：預變性溫度 94 ℃：2分鐘，解鏈溫度94 ℃ ：20秒，退火溫度53 ℃：30秒，復性溫度72 ℃：30秒。共經過50個循環。擴增結束后，每一個標本都會得到一個Ct值，它是熒光信號超過閾值所需的循環數。PCR擴增效率采用公式E=10-1/slope計算。MMP-7的相對表達率R的計算基于PCR擴增效率E以及樣本和對照的差(ΔCt)。R = (EMMP-7)ΔCtMMP-7 (control-sample)/(Eβ-actin)ΔCtβ-actin (control-sample)。R>1時表明MMP-7在胃癌(樣本組)中相對于胃正常黏膜組織(對照組)高表達。

1.3統計學方法采用基于隨機化檢測的統計學分析軟件REST(relative expression software tool)對MMP-7在胃癌及胃正常組織的表達變化進行檢測[4]。SPSS 16.0軟件基于卡方檢驗對MMP-7表達變化與胃癌臨床病理學指標的差異進行統計分析。基于對數秩檢驗的Kaplan-Meier法進行生存分析。P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1MMP-7在胃癌和胃正常黏膜的表達變化MMP-7 mRNA在所有標本中均能被檢測，RT-PCR擴增產物為設計長度(MMP-7，122bp；GADPH，141bp)。在50個擴增循環中未發現引物二聚體。將5個等比例濃度梯度的cDNA進行擴增后得到的Ct值輸入REST軟件則獲得本反應體系下PCR擴增效率。在本實驗中MMP-7和GADPH的PCR擴增效率分別為1.88和1.72。在所有的112份配對的樣本中，86例R>1，這表明MMP-7在這些患者的癌組織中相對于正常黏膜組織高表達。如表2所示，MMP-7在胃癌的表達強度是其在胃正常黏膜中表達強度的4.382倍(P= 0.001)。

表2 REST軟件對胃癌和胃正常黏膜中MMP-7表達變化的輸出結果

2.2MMP-7不同表達水平下胃癌臨床病理特征的比較如表3所示，在MMP-7表達上調和表達下調中，胃癌的TNM分期、浸潤深度、淋巴結轉移、脈管浸潤比較差異有統計學意義(P< 0.05)，而性別、年齡、腫瘤大小及分化程度比較，差異無統計學意義(P> 0.05)。

表3 MMP-7不同表達水平胃癌臨床病理學特征的比較

2.3不同MMP-7表達水平胃癌患者的生存分析

無論是總生存率(P= 0.008)還是無病生存率(P= 0.015)，MMP-7表達上調的胃癌患者均較其表達下調的患者差。胃癌的中位生存時間及五年生存率在MMP-7表達上調和下調的患者中分別是26個月和40.7%以及66個月和69.2%。

圖1 不同MMP-7表達水平胃癌患者的生存曲線

圖2 不同MMP-7表達水平胃癌患者的無病生存率

3 討論

癌癥轉移的機制至今尚未完全闡明，是一個多步驟、多階段的復雜過程。一般認為癌細胞需穿過細胞外基質以及脈管基底膜進入循環系統從而發生全身轉移。其中對細胞外基質和脈管基底膜的降解是其必要條件。MMPs已被證明可以降解細胞外基質和脈管基底膜，能夠促進腫瘤新生血管的形成，與腫瘤的浸潤、轉移密切相關[5]。1988年被首次報道的MMP-7基因位于11號染色體，包含有267個氨基酸，因其缺乏碳末端蛋白結構域是MMPs家族中最小的成員[6]。MMP-7在眾多腫瘤組織中過表達，被認為在細胞增殖、凋亡、浸潤、轉移以及血管生成等多個環節參與了腫瘤的發展。

本研究通過實時熒光定量PCR技術檢測在112例配對的胃癌組織及癌旁正常黏膜組織中MMP-7的表達變化，進一步證實在mRNA水平，相對于正常胃黏膜，MMP-7在胃癌中高表達。MMP-7表達上調的胃癌患者中，TNM分期更晚，腫瘤浸潤深度更深，更易出現淋巴結轉移和脈管浸潤。由此可知MMP-7隨胃癌的發展而表達逐漸增高。有淋巴結轉移的胃癌患者MMP-7表達上調的概率更高，這與既往的報道一致[7]。這表明MMP-7表達與腫瘤的轉移相關，而腫瘤的轉移與腫瘤患者的預后密切相關，同時本研究通過生存分析直接觀察到MMP-7表達上調的患者壽命更短，腫瘤也更容易復發轉移。前期已有報道表明在喉癌、結直腸癌及食管癌患者中，MMP-7表達高則意味著更差的預后[8～10]。是否在更多的腫瘤中MMP-7也具有相同的判斷預后能力，則需要進一步的研究。

該研究采用實時熒光定量PCR技術發現MMP-7在胃癌組織中的表達顯著高于胃正常黏膜組織，且MMP-7不同表達水平的胃癌患者病理分期、腫瘤浸潤深度、有無淋巴結轉移和脈管浸潤是有差異的，表明MMP-7在胃癌的發生、發展及轉移中發揮了重要的作用。而MMP-7高表達的胃癌患者有著更差的預后則表明該基因有望成為判斷胃癌患者預后的生物標志物。能否通過RNA干擾技術下調MMP-7表達來治療胃癌，需要下一步研究和實驗證明。

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ClinicopathologicalandprognosticsignificanceofupregulatedMMP-7ingastriccancer

SHENXiao-gang，GUOZhi-yi，ZHAOGao-ping，WANGLin

(DepartmentofGastrointestinalSurgery，SichuanAcademyofMedicalSciences&SichuanProvincialPeople’sHospital，Chengdu610072，China)

ObjectiveTo evaluate the clinicopathological significance of MMP-7 expression and investigate its prognostic value in gastric cancer.MethodsMMP-7 mRNA expression in cancerous tissue and corresponding normal mucosa tissue from 112 gastric cancer patients were analyzed by quantitative real-time RT-PCR.The clinicopathological characteristics and survival rates were compared among patients with various expression levels.ResultsThe expression of MMP-7 mRNA was found to be upregulated in cancerous tissue compared to normal mucosa tissue (P= 0.001).The expression levels were associated with advanced TNM stage (P= 0.037)，enhanced penetration depth (P= 0.028)，lymph node metastasis (P= 0.015) and vessel invasion (P= 0.042).Patients with upregulated MMP-7 showed a worse overall survival (P= 0.008) and disease free survival (P= 0.015).ConclusionThe expression of MMP-7 is upregultaed in cancer and associated with a decreased survival rate in patients with gastric cancer.

MMP-7；Gastric cancer；Metastasis；Prognosis

R735.2

A

1672-6170(2017)05-0128-04

2017-02-18；

2017-05-22)