雙熒光標(biāo)記小鼠模型研究破骨細(xì)胞融合

唐 勇，吳家順，牛好曼，代璐嶺，楊 肖

(1.成都銅雀臺整形美容醫(yī)院美容牙科，四川 成都 610041；2.四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041)

雙熒光標(biāo)記小鼠模型研究破骨細(xì)胞融合

唐 勇1，吳家順2，牛好曼2，代璐嶺2，楊 肖2

(1.成都銅雀臺整形美容醫(yī)院美容牙科，四川 成都 610041；2.四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041)

目的利用雙熒光標(biāo)記小鼠模型觀察破骨細(xì)胞的融合過程并探討不同濃度的細(xì)胞核因子κB受體活化因子配體(RANKL)和甲狀旁腺激素(PTH)對破骨細(xì)胞融合效率的影響。方法使用5周齡CTSK-Cre和的ROSAmt/mg兩種轉(zhuǎn)基因小鼠，前者無熒光表達(dá)而在其破骨細(xì)胞中表達(dá)CRE重組酶，后者表達(dá)紅色熒光(tomato)。處死兩種小鼠并沖出骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)且以1∶1的比例混合培養(yǎng)。將不同濃度的RANKL和PTH加入共培養(yǎng)體系，計(jì)算綠色熒光的量。結(jié)果CTSK-Cre和ROSAmt/mg2種轉(zhuǎn)基因小鼠BMSCs共培養(yǎng)第5天觀察到綠色熒光陽性的細(xì)胞出現(xiàn)；RANKL組：隨著RANKL濃度的升高，共培養(yǎng)體系內(nèi)綠色熒光陽性的細(xì)胞數(shù)不斷增加；PTH組：共培養(yǎng)體系內(nèi)綠色熒光陽性的細(xì)胞數(shù)與PTH濃度之間未發(fā)現(xiàn)明顯的相關(guān)性。結(jié)論基于cre-loxp系統(tǒng)建立的cre重組酶誘導(dǎo)的雙熒光標(biāo)記小鼠模型可有效用于破骨細(xì)胞融合過程的研究；RANKL的濃度越高其誘導(dǎo)破骨細(xì)胞融合的效率越高；PTH與破骨細(xì)胞的融合效率之間無明顯的劑量相關(guān)規(guī)律。

破骨細(xì)胞；細(xì)胞融合；CTSK-Cre；ROSAmt/mg

骨吸收異常是當(dāng)代醫(yī)學(xué)試圖克服的重大難題之一。異常的骨吸收會導(dǎo)致一系列的臨床疾病，包括骨質(zhì)疏松癥、惡性高鈣血癥，以及包括牙槽骨在內(nèi)的骨的炎癥性吸收和牙齒萌出異常等。而破骨細(xì)胞在骨吸收過程中發(fā)揮著最主要的作用。破骨細(xì)胞是由骨髓中的髓系祖細(xì)胞分化而成的單核巨噬細(xì)胞相互融合，所形成的多核巨細(xì)胞[1]。而細(xì)胞融合是破骨細(xì)胞形成過程中必不可少的環(huán)節(jié)，也是破骨細(xì)胞重要的特點(diǎn)之一。研究破骨細(xì)胞融合的傳統(tǒng)方式往往對其形成過程探究有限。因此我們試圖尋找一種簡單直接而又有效的方法來研究破骨細(xì)胞的融合過程。本實(shí)驗(yàn)采用基于cre-loxp系統(tǒng)建立的cre重組酶誘導(dǎo)的雙熒光標(biāo)記小鼠模型來研究破骨細(xì)胞的融合過程及其影響因素。旨在為破骨細(xì)胞融合及骨吸收的臨床用藥提供新的指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物2014年12月至2017年2月，轉(zhuǎn)基因小鼠CTSK-Cre與ROSAmt/mg各12只(The Jackson Laboratory，美國)，5周齡，SPF級。該轉(zhuǎn)基因小鼠購自美國杰克遜實(shí)驗(yàn)室。飼養(yǎng)于四川大學(xué)生物治療國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基因工程小鼠中心。所用飼料營養(yǎng)全面均衡，經(jīng)過嚴(yán)格無菌處理。小鼠飲用水、木屑墊料及培養(yǎng)籠經(jīng)嚴(yán)格高溫高壓處理，空氣經(jīng)層流過濾，動物房飼養(yǎng)環(huán)境達(dá)到無特定病原體SPF級別。

1.2試劑a-MEM、特級胎牛血清(hyclone公司，澳大利亞)、青霉素/鏈霉素(Hyclone公司，美國)，鼠重組細(xì)胞核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand，RANKL)、甲狀旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor，MCSF)(Peprotech公司，美國)、熒光顯微鏡(Olympus CKX41，Japan)。

1.3兩種轉(zhuǎn)基因小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞混合培養(yǎng)頸椎脫臼法處死5周齡CTSK-Cre與ROSAmt/mg小鼠，兩種小鼠使用同樣的方法處理并取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞混合75%乙醇浸泡消毒2分鐘。無菌條件下分離股骨及脛骨于無菌PBS中，去除附著肌肉及韌帶，剪斷兩側(cè)骨骺端，用注射針頭將a-MEM輕輕沖洗骨髓腔于50 ml無菌離心管中。分別全都沖出后，注射器反復(fù)吹打成細(xì)胞懸浮液，細(xì)胞計(jì)數(shù)，用a-MEM完全培養(yǎng)液將細(xì)胞密度調(diào)整至5×106個/ml。將兩種小鼠來源的細(xì)胞以1：1的比例混合后接種于6孔板中，每孔培養(yǎng)基2 ml。37 ℃，5%CO2條件下完全培養(yǎng)基(含 α-MEM培養(yǎng)基、10%胎牛血清、1% 青霉素/鏈霉素)培養(yǎng)。分別在細(xì)胞培養(yǎng)后的每天使用熒光顯微鏡觀察是否有綠色熒光(GFP)表達(dá)，當(dāng)GFP出現(xiàn)時采圖。

1.4不同濃度的RANK和PTH對破骨細(xì)胞融合效率的影響將兩種轉(zhuǎn)基因小鼠骨髓來源的單核細(xì)胞以1∶1的比例混合后種于6孔板中，每孔培養(yǎng)基2 ml，每孔加入巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF，終濃度為50 ng/ml)。同時將不同濃度的RANKL和PTH(分別為10、50、100、200、300 ng/ml)加入以上的共培養(yǎng)體系。37 ℃，5%CO2條件下完全培養(yǎng)基(含 α-MEM培養(yǎng)基、10%胎牛血清、1% 青霉素/鏈霉素)培養(yǎng)。分別在細(xì)胞培養(yǎng)第3、6、9天，使用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞行為并采圖。從細(xì)胞培養(yǎng)第二天開始直至培養(yǎng)結(jié)束，每天通過對孔板內(nèi)表達(dá)GFP的細(xì)胞數(shù)量計(jì)數(shù)，繪制綠色熒光細(xì)胞數(shù)隨著細(xì)胞培養(yǎng)時間變化的趨勢圖。

2 結(jié)果

2.1兩種轉(zhuǎn)基因小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞混合培養(yǎng)后的熒光表達(dá)情況當(dāng)培養(yǎng)至第2天時熒光顯微鏡下并未觀察到明顯的GFP陽性的細(xì)胞出現(xiàn)(圖1 a所示)，而培養(yǎng)進(jìn)行至第5天時鏡下出現(xiàn)明顯空泡狀的破骨細(xì)胞(灰色箭頭)，同時熒光顯微鏡下就可以觀察到GFP陽性的細(xì)胞(綠色箭頭)出現(xiàn)(圖1b)。

2.2不同濃度的RANKL與PTH對共培養(yǎng)體系內(nèi)破骨細(xì)胞融合效率的影響標(biāo)號1-5Rankl的濃度依次為10、50、100、200、300 ng/ml。熒光顯微鏡采集的圖片顯示，隨著Rankl濃度的增高，視野內(nèi)GFP的量也隨之增加，而紅色熒光(tomato)的表達(dá)量會隨之減少(圖2a)。并根據(jù)不同濃度的Rankl組表達(dá)GFP陽性細(xì)胞數(shù)隨時間的變化，繪制其變化趨勢圖(圖2b)。

圖1 混合培養(yǎng)體系熒光及倒置顯微鏡采圖 a.混合培養(yǎng)2天；b.混合培養(yǎng)5天(10X)

而不同濃度的PTH組，標(biāo)號1-5PTH的濃度依次為10、50、100、200、300 ng/ml。隨著PTH濃度的增加，視野內(nèi)GFP陽性的量并未表現(xiàn)出明顯的劑量相關(guān)性(圖3a)。并根據(jù)不同濃度的PTH組表達(dá)GFP陽性細(xì)胞數(shù)隨時間的變化，繪制其變化趨勢圖(圖3b)。

圖2 RANKL組GFP陽性細(xì)胞熒光及變化趨勢圖 a.Rankl組熒光圖(10X)；b.Rankl組GFP變化趨勢圖

圖3 PTH組GFP陽性細(xì)胞熒光及變化趨勢圖 a.PTH組熒光圖(10X)；b.PTH組GFP變化趨勢圖

3 討論

破骨細(xì)胞是來源于造血干細(xì)胞或單核前體細(xì)胞的多核巨細(xì)胞[1]，細(xì)胞融合在破骨細(xì)胞的形成以及行使功能的過程中發(fā)揮著重要的作用。骨穩(wěn)態(tài)由成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞共同維持[2]，而破骨細(xì)胞功能異常會引起一系列的臨床癥狀和功能異常，因此研究破骨細(xì)胞的融合過程以及其影響因素，可以為臨床治療及用藥提供指導(dǎo)意義。為了更直觀有效地觀察破骨細(xì)胞的融合過程，我們構(gòu)建了雙熒光標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因小鼠模型。在該模型中我們可以根據(jù)綠色熒光是否出現(xiàn)以及其出現(xiàn)的量的多少來判斷破骨細(xì)胞前體是否發(fā)生融合以及融合效率的差異。

為了驗(yàn)證該模型的有效性，我們首先將兩種轉(zhuǎn)基因小鼠，即CTSK-Cre與ROSAmt/mg骨髓來源的單核細(xì)胞以1∶1的比例混合培養(yǎng)。二者共培養(yǎng)5天后便觀察到了綠色熒光的出現(xiàn)，該結(jié)果表明CTSK-Cre與ROSAmt/mg轉(zhuǎn)基因小鼠的破骨細(xì)胞前體細(xì)胞發(fā)生了融合，Cre重組酶發(fā)揮作用并剪切后者編碼紅色熒光(tomato)的基因片段，使得融合后的破骨細(xì)胞表達(dá)GFP。

因此本實(shí)驗(yàn)利用該模型來研究不同濃度的PTH和RANKL對破骨細(xì)胞融合效率的影響。RANKL屬于腫瘤壞死因子配體超家族成員，對于破骨細(xì)胞的形成、發(fā)揮功能及存活是必須的。同時有研究表明，在淋巴細(xì)胞分化、乳腺發(fā)育、腸內(nèi)皺褶細(xì)胞的產(chǎn)生、雌性動物的體溫調(diào)節(jié)等過程中RANKL也發(fā)揮著重要的作用[3]。RANKL有兩種受體：一種是RANK，主要表達(dá)于破骨細(xì)胞前體及破骨細(xì)胞表面；當(dāng)RANKL與破骨細(xì)胞膜表面的RANK受體結(jié)合時，便會啟動一系列基因轉(zhuǎn)錄，并且誘導(dǎo)破骨細(xì)胞前體相互之間的融合，進(jìn)而促進(jìn)破骨細(xì)胞的形成及分化，并抑制其凋亡；另一種受體為OPG，其對RANKL和RANK的結(jié)合起負(fù)調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而抑制破骨細(xì)胞的形成和分化[4]。RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)在調(diào)節(jié)骨代謝和維持骨穩(wěn)態(tài)的過程中發(fā)揮重要作用[5]。本實(shí)驗(yàn)中為了研究不同濃度的RANKL對破骨細(xì)胞融合效率的影響，將稀釋后的不同濃度的RANKL加入到兩種轉(zhuǎn)基因小鼠骨髓來源單核細(xì)胞的共培養(yǎng)體系，我們發(fā)現(xiàn)RANKL對破骨細(xì)胞融合效率的影響與以往的研究一致，即Rankl濃度越高，破骨細(xì)胞的融合效率越高，破骨細(xì)胞的形成對Rankl呈現(xiàn)出濃度依賴性。

PTH是由甲狀旁腺分泌的用以調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)鈣、磷代謝平衡的重要激素之一，其主要靶器官是骨、小腸和腎臟。在骨組織內(nèi)，PTH是調(diào)節(jié)骨重建的主要激素，通過對骨形成和骨吸收的調(diào)控作用行使其功能。當(dāng)間歇性給予PTH時，它會通過增加成骨細(xì)胞的量及其活性來促進(jìn)骨形成；而持續(xù)給藥時，PTH會通過刺激骨吸收來減少骨形成。PTH的受體主要在成骨細(xì)胞以及前成骨細(xì)胞表達(dá)。因此，我們認(rèn)為，當(dāng)持續(xù)給予PTH時，其對骨吸收的促進(jìn)作用是由于PTH首先作用于成骨細(xì)胞，成骨細(xì)胞分泌的因子激活破骨細(xì)胞，進(jìn)而導(dǎo)致骨吸收。有文獻(xiàn)指出當(dāng)骨吸收作用被抑制時，間歇性應(yīng)用PTH對于骨形成的促進(jìn)作用也會受到影響，因此PTH對于骨形成的促進(jìn)作用可能需要骨吸收的誘導(dǎo)[6]。而此過程最終的結(jié)果是骨形成多于骨吸收，而骨吸收的發(fā)生只是成骨細(xì)胞發(fā)揮作用前一過性的反應(yīng)。然而此過程中破骨細(xì)胞的激活機(jī)制仍不清楚。所以PTH是通過成骨細(xì)胞間接的發(fā)揮對破骨細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用，并通過二者之間復(fù)雜的相互作用來調(diào)節(jié)骨重建。而在PTH對于破骨細(xì)胞融合效率的研究中，我們直接將不同濃度的PTH直接加入到骨髓來源的單核細(xì)胞，PTH對于破骨細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用十分復(fù)雜，對于體內(nèi)環(huán)境的模擬有限。因此實(shí)驗(yàn)結(jié)果并未反應(yīng)出二者明顯的相關(guān)性。找到并建立一種合適的模型對于研究PTH對破骨細(xì)胞的雙重作用至關(guān)重要，并為PTH治療骨代謝紊亂疾病提供臨床指導(dǎo)。

[1] Chambers TJ.The cellular basis of bone resorption[J].Clin Orthop Relat Res，1980，151(151)：283-293.

[2] 吳爽，蔣科，蔚芃，等.骨代謝指標(biāo)與骨關(guān)節(jié)炎患者骨密度變化的相關(guān)性研究[J].實(shí)用醫(yī)院臨床雜志，2015，12(3)：57-59.

[3] Hanada R，Leibbrandt A，Hanada T，et al.Central control of fever and female body temperature by RANKL/RANK[J].Nature，2009，462：505-509.

[4] Karmakar S，Kay J，Gravallese EM.Bone damage in rheumatoid arthritis：mechanistic insights and approaches to prevention[J].RheumDis Clin North Am，2010，36(2) ：385-404.

[5] 田娟，龍麗，周彬.類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎骨侵蝕研究進(jìn)展[J].實(shí)用醫(yī)院臨床雜志，2017，14(2)：133-136.

[6] 萬啟龍，王強(qiáng)，李祖兵.PTH對骨代謝雙重作用的研究進(jìn)展[J].中國口腔頜面外科雜志，2011，9(4)：343-346.

楊 肖

R318

A

1672-6170(2017)05-0020-03

2017-03-11；

2017-07-23)