鹽脅迫下苜蓿種質資源萌發特性綜合評價

陳小芳， 于德花， 寧 凱， 徐化凌， 畢云霞

(東營市農業科學研究院， 山東 東營 257091)

我國是世界鹽堿地大國之一，約有667萬hm2鹽堿地[1]，過度的開發利用致使次生鹽堿地面積還在不斷擴張[2-4]，土壤鹽漬化問題是我國乃至世界農業生產都面臨的困境，同時也對生態環境和社會經濟造成嚴重危害。改良鹽漬土過程復雜、難度大、耗時長，種植耐鹽牧草是最為有效、經濟的改良措施。苜蓿(Medicagosativa. L)葉片具有排鹽機制[5]，耐鹽能力較強，利用品種間的耐鹽性差異培育耐鹽良種，可在改良鹽堿地的同時，提供優質蛋白質飼料，為鹽堿地農牧業發展拓寬道路。

植物的耐鹽性與其遺傳因素及個體的發育階段有關，種子能夠在鹽脅迫下萌發成苗，是植株在鹽堿地成功定植的基礎[6-8]。苜蓿耐鹽機制發揮調節作用由特定的基因型決定，而且調節機制會隨分化水平的變化而變化[9]。鹽堿地中生長的苜蓿，各生長發育階段都會受到鹽脅迫的影響，其中對鹽脅迫最敏感的時期為種子萌發期，由于地表土壤和地下土壤的鹽度相差大約2～10倍，因而苜蓿種子萌發期面臨的鹽脅迫遠大于其他生長發育階段，苜蓿種子發芽期耐鹽性評價對耐鹽性苜蓿材料的選擇和培育至關重要[10]，這與Al-khatib等[11]、劉卓和徐安凱[12]部分研究結論一致。本試驗以23份苜蓿種質為材料，研究其種子在不同鹽濃度脅迫下的萌發特性，通過對各項指標與耐鹽性的相關性分析，篩選出苜蓿耐鹽能力鑒定簡潔有效的指標，為今后的耐鹽性評價及耐鹽苜蓿品種選育提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2016年7月-2016年11月進行，共23份苜蓿種質，分別來源于中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所、山東農業工程學院、斯洛文尼亞農業研究所，種子名錄及來源如表1所示。

表1 苜蓿種質名錄及來源Table 1 List of alfalfa germplasms and origins

1.2 試驗方法

根據《牧草種子檢驗規程》[13]選取成熟、大小一致、健康種子為試驗材料，選用化學純NaCl配制0.20%，0.40%，0.60%，0.80%，1.00%，1.20%和1.40%質量分數的鹽溶液(蒸餾水為對照)，每梯度設置3個重復。供試種子用0.50%的次氯酸鈉表面消毒5 min，蒸餾水沖洗干凈，在直徑100 mm的培養皿中均勻擺放100粒種子，加入4.5 mL NaCl溶液，用封口膜封好，置于25℃恒溫培養箱內暗培養。

1.3 測定指標及方法

發芽勢從第4 d開始統計，以后每隔一天統計一次，第8 d最后一次統計；發芽率在培養第10 d統計；處理12 d后，測定根長和苗高，每個重復隨機選取10株苗。按照下列方法計算各項指標：

發芽指數(GI)=ΣGt/Dt(Gt表示處理后t日的發芽數，Dt表示相應的發芽日數)；

活力指數(VI)=GI×S(GI為發芽指數，S為平均根長)；

1.4 數據處理與分析

1)隸屬函數分析：

對于不同的測定指標來說，有的指標變化的最大值與最小值之間差異非常大，因而該指標的絕對值在參與整個評價過程中所占的比重就比較大，對評價結果影響也就比較大[14]；而有的指標品種間差異比較小，則該指標的絕對值在綜合評價過程中的貢獻就可能比較小。這樣就可能錯誤擴大或縮小某一個性狀與品種品質的相關性。根據隸屬函數的方法，對各品種各個指標求其隸屬值并累加，綜合比較各個品種，可消除因絕對值大小不同而可能造成的對正確評價材料優劣所作的貢獻的不同[15]。

(1)

(2)

Yij為i品種的j指標的隸屬函數值，Xij為i品種的j指標的均值，Xjmax為各品種j指標均值的最大值，Xjmin為各品種j指標均值的最小值。若j指標與耐鹽性成正相關，則用公式(1)；若j指標與耐鹽性成負相關，則用公式(2)[16]。

2)采用Excel 2003軟件進行數據處理，用DPS V6.55統計分析軟件進行方差分析、聚類分析和相關性分析。

2 結果與分析

2.1 種苗耐鹽性測定

2.1.1鹽脅迫對種子發芽勢、發芽率的影響 發芽勢表征種子萌發初期的發芽力。方差分析表明(表2)，在相同NaCl鹽濃度下各苜蓿種質的發芽勢均呈極顯著差異(P<0.01)。23個苜蓿種子發芽勢大體上隨著鹽濃度的增加而降低，說明脅迫作用越強種子的發芽能力越弱。0.20%，0.40%，0.60%鹽濃度下，分別有11、13、11份種質的種子發芽勢高于對照，當鹽濃度達到0.80%和1.00%時，只有9份和5份種質的種子發芽勢高于對照，其他的都降低。隨著NaCl鹽濃度進一步增加，到1.20%時除‘4030’略微高于對照外，所有苜蓿種質種子發芽勢均明顯低于對照，‘游客’降幅最大，達85.41%。

表2 不同濃度NaCl脅迫對苜蓿種子發芽勢的影響Table 2 Effects of different NaCl concentration on the germination potential of alfalfa germplasms

續表2

注：同列不同小寫字母表示各品種間差異顯著(P<0.05)；*表示在0.05水平上差異顯著：**表示在0.01水平上差異極顯著，下同

Note: Different lower case letters within the same column indicate significant difference at the 0.05 level. * and ** indicate significant difference at the 0.05 and 0.01 level, respectively. The same as below

相同NaCl濃度下，不同種質間發芽率差異達極顯著水平(P<0.01)(表3)。0.20%，0.40%和0.60%鹽濃度下，分別有9份、13份和13份種質的種子發芽率高于對照，當鹽濃度達到0.80%時，只有7份種質的種子發芽勢高于對照。隨著NaCl鹽濃度進一步增加，到1.00%時所有苜蓿種質的種子發芽勢均明顯低于對照，‘游客’降幅最大，達41.59%，說明1.00%鹽濃度極大的限制了苜蓿種子的萌發。

表3 不同濃度NaCl脅迫對苜蓿種子發芽率的影響Table 3 Effects of different NaCl concentration on the germination rate of alfalfa germplasms

續表3

2.1.2鹽脅迫對苜蓿根長的影響 研究脅迫環境對種子萌發的影響時，多以根的生長作為指標之一[17]。方差分析表明，在相同NaCl鹽濃度下各種質的根長差異極顯著(P<0.01)。與發芽率相比，隨著NaCl濃度的升高，只有部分種質幼根伸長受到抑制(表4)。NaCl鹽濃度為0.40%，0.60%，0.80%和1.00%時，所有試驗材料根長均大于對照，0.60%時根長達到最大，說明低鹽溶液一定程度上促進幼根生長。隨著NaCl濃度的增加，促進作用逐漸減弱，當NaCl濃度為1.20%時，有13份種質幼根均低于對照，隨著NaCl鹽濃度進一步增加，到1.40%時,除‘中苜3號’和‘巨能2’外，所有苜蓿種質根長均明顯低于對照，‘金皇后’降幅最大，達65.92%，說明‘中苜3號’和‘巨能2’耐鹽性更強。

表4 不同濃度NaCl脅迫對苜蓿根長的影響Table 4 Effects of different NaCl concentration on the radicle growth of alfalfa

續表4

2.1.3鹽脅迫對苜蓿苗高的影響 方差分析表明，相同NaCl濃度下不同種質間苗高呈極顯著差異(P<0.01)。NaCl鹽濃度0.20%，0.40%，0.60%時，部分種質苗高大于對照，其中0. 40%NaCl處理下12個品種(系)苗高大于對照，‘WL-SALT’比對照增加19.15%，其次為‘中苜3號’和‘游客’，分別增加12.97%和11.73%，其余9個品種(系)增加率都在10%以下，說明低濃度鹽分對苜蓿苗高的促進作用有限；隨著NaCl鹽濃度的升高，0.80%及以上鹽濃度處理下，幼苗苗高顯著低于對照。均值比較表明，除0.40%NaCl鹽濃度下苜蓿種質的平均苗高略高于(比對照高1.27%)對照外，整體呈現下降的趨勢，1.40%NaCl鹽濃度下苜蓿種質的平均苗高僅為對照的一半，高鹽濃度極大地抑制了幼苗的生長。幼苗生長高的苜蓿耐鹽性較強，排名前5位的分別是‘巨能2’、‘中苜1號’、‘L3003’、‘KRIMA’和‘耐鹽之星’。

表5 不同濃度NaCl脅迫對苜蓿苗高的影響Table 5 Effects of different NaCl concentration on the seedling height of alfalfa

續表5

2.1.4苜蓿耐鹽系數比較及聚類分析 不同苜蓿種質發芽率、苗高、根長和發芽指數耐鹽系數差異明顯，均達極顯著水平(P<0.01)，根長的變化幅度最大為1.30～0.76(表6)。指標的耐鹽系數大則說明品種(系)的耐鹽性強，發芽率、發芽指數、根長、苗高耐鹽系數最高的分別是‘4030’，‘巨能2’、‘中苜5號’和‘WL-SALT’，最低的是‘L3003’、‘游客’、‘WL414’和‘SOCA’。

表6 NaCl脅迫下苜蓿發芽率、苗高、根長、發芽指數耐鹽系數差異Table 6 Differences of salt tolerance coefficient of seed germination rate, seedling height, root length，andgermination index of different alfalfa under NaCl stress

對發芽率、發芽指數、根長、苗高的耐鹽系數進行標準化處理，以歐氏距離法對23份苜蓿種質進行聚類分析，可將其分為3類，第一類為強耐鹽種質：包括‘中苜1號’、‘中苜5號’、‘耐鹽之星’、‘WL-SALT’、‘賽迪10’、‘巨能2’、‘巨能801’和‘KRIMA’共8個品種(系)，占34.78%；第二類為中等耐鹽種質：包括‘WL414’、‘3010’、‘4030’、‘601FY’、‘Hunter River’、‘皇冠’、‘皇后苜蓿’、‘金皇后’、‘苜蓿王’、‘BISTRA’和‘SOCA’共11個品種(系)，占47.83%；第三類為弱耐鹽種質：包括‘中苜3號’、‘游客’、‘L3003’、‘中苜4號’共4個品種(系)，占17.39%。

圖1 苜蓿發芽率、苗高、根長、發芽指數耐鹽系數聚類圖Fig.1 Dendrogram of different cultivars (strain) based on salt tolerance coefficient of seed germination rate,seedling height, root length and germination index

2.1.51.20%鹽濃度下苜蓿種質耐鹽抑制率及聚類分析 方差分析表明(表7)，1.20%NaCl鹽濃

度下，不同種質間發芽率、苗高、根長和發芽指數的相對抑制率均呈極顯著差異(P<0.01)，指標的相對抑制率大則說明受到鹽脅迫的抑制作用弱，耐受鹽脅迫的能力強，更加耐鹽。從相對抑制率的值來看，發芽率的相對抑制率最高的是‘WL414’，最低的是‘中苜4號’；發芽指數相對抑制率最高的是‘巨能801’，最低的是‘L3003’；根長相對抑制率最高的是‘中苜3號’，最低的是‘金皇后’；苗高相對抑制率最高的是‘中苜4號’，最低的是‘WL414’。

以發芽率、發芽指數、根長、苗高的相對抑制率為依據，聚類分析方法同上，可將其分為3類(圖2)，第一類為強耐鹽種質：包括‘中苜1號’、‘中苜5號’、‘耐鹽之星’、‘賽迪10’、‘巨能801’、‘苜蓿王’、‘BISTRA’和‘KRIMA’共8個品種(系)，占34.78%；第二類為中等耐鹽種質：包括‘游客’、‘WL414’、‘3010’、‘4030’、‘601FY’、‘Hunter River’、‘皇冠’、‘皇后苜蓿’、‘金皇后’、‘L3003’和‘SOCA’共11個品種(系)，占47.83%；第三類為弱耐鹽種質：分別是‘中苜3號’、‘WL-SALT’、‘巨能2’和‘中苜4號’共4個品種(系)，占17.39%。

表7 1.20% NaCl脅迫下苜蓿發芽率、苗高、根長、發芽指數相對抑制率差異Table 7 Effects of 1.20% NaCl stress on the inhibition rate of germination rate, seedling height, root length andgermination index of different alfalfa

圖2 1.20% NaCl質量分數下各品種(系)發芽率、苗高、根長、發芽指數抑制率聚類樹狀圖Fig.2 Dendrogram of different cultivars(strain)based on germination rate, seedling height, root length，and germination index under 1.20% NaCl stress

2.2 應用隸屬函數分析法進行耐鹽性綜合評價

不同種質受鹽脅迫影響的程度可通過隸屬值反映，隸屬值越大，鹽造成的影響越小，植株的耐鹽能力越強。以發芽率、發芽指數、根長、苗高和活力指數為依據，對23個苜蓿種質進行分析，結果表明(表8)，耐鹽性排在前3位的是‘游客’、‘賽迪10’、‘中苜3號’，‘巨能801’的耐鹽性最弱。

2.3 種子萌發期耐鹽性評價指標的相關性分析

鹽脅迫對種子發芽率、發芽指數、根長、苗高、活力指數等方面都有較明顯的影響，從這些指標與鹽濃度的相關性分析結果可以看出，供試苜蓿種子的發芽率、發芽指數、苗高與鹽濃度成極顯著負相關；‘中苜3號’根長與鹽濃度成顯著正相關，其余13個品種(系)根長與鹽濃度成顯著至極顯著負相關；除‘中苜1號’、‘中苜3號’和‘巨能2’的活力指數與鹽濃度相關性不顯著外，其余20個品種(系)活力指數與鹽濃度成顯著至極顯著負相關(表9)。

表8 NaCl脅迫下各品種(系)隸屬函數分析Table 8 Membership function analysis of different cultivars(strain) under NaCl stress

表9 苜蓿種子萌發階段測定指標與鹽濃度的相關性分析Table 9 Correlative analysis between germination index and salt concentration in alfalfa seed germination stage

3 討論與結論

植物耐鹽性評價是一個較復雜的問題，耐鹽能力的大小是多種代謝的綜合表現[18]。種子的耐鹽性與種子活力關系密切[8]，而種子活力主要決定于遺傳以及種子發育成熟程度與貯藏期間的環境因子。遺傳性決定種子活力強度的可能性，發育程度決定活力程度表現的現實性，貯藏條件則決定種子活力下降的速度。當種子處于最佳成熟時期、最適保存環境時，種子活力強，相應的耐鹽能力也強。劉大林等[19]研究指出鹽脅迫對種子萌發活力指數的影響大于對種子相對發芽率的影響，這一結果說明鹽脅迫對苜蓿種子萌發速度的影響大于對萌發能力的影響。鹽脅迫對種子發芽勢、發芽率、根長、苗高等萌發特性的影響不同，即單項指標在表征耐鹽性中所占的分量不同，同一指標分析相同品種可能得到不同的結果，因此任一單項指標都不能夠全面評價耐鹽能力。從各指標的相關性分析可以看出，測定的所有指標都存在著不同程度的相關性[20]，必須以多指標、廣角度綜合分析才更具科學性和可靠性。

23份苜蓿種質種子萌發及幼苗耐鹽性研究結果表明，鹽溶液脅迫下根和苗的生長所受影響有差異。0.40%～0.80%的低鹽濃度對苜蓿根的生長有促進作用，1.00%的較高鹽濃度沒有明顯的促進作用，鹽濃度達1.20%時促進作用完全消失，明顯抑制根的生長；NaCl濃度為0.40%時促進苜蓿苗的生長， 0.60%時則開始抑制苗的生長。韓清芳等[21]、王征宏等[22]認為低鹽濃度促進苜蓿根的生長，本試驗進一步揭示，低鹽濃度促進苜蓿根和苗的生長，尤其在NaCl質量分數為0.40%時，對二者的促進作用最大，隨著NaCl濃度的增加，促進作用減弱直至產生抑制作用。

種子萌發的第一步是吸水，鹽濃度決定吸水，低濃度的鹽溶液有調節滲透壓、促進種子吸水的作用，最終促進種子萌發。高鹽濃度時種子吸水不足，不能利用子葉中的儲藏物質，呼吸作用受到抑制，種子難以萌發[23-24]。試驗中測試種子在0.20%，0.40%，0.60% NaCl鹽濃度下部分種質的種子發芽勢高于對照，在0.80%及以上的NaCl處理下，種質發芽勢高于對照的趨勢逐漸減弱，這與馬宗琪等[25]研究結論一致。NaCl濃度為1.20%和1.40%時，各苜蓿種質發芽勢、發芽率、根長及苗高均達到極顯著差異(P<0.01)，1.20%及以上鹽濃度對于苜蓿種子萌發的抑制作用顯著增強，1.20%是苜蓿耐鹽性的轉折點，可作為耐鹽鑒定的最佳NaCl濃度。以耐鹽系數和相對抑制率分別進行聚類分析，兩者的聚類分析結果中，強、中、弱3類耐鹽品種所占比重無變化，但每個等級中苜蓿品種發生了變動。

苜蓿萌發期受不同鹽濃度溶液脅迫，指標之間所表現出的耐鹽性結果存在差異，綜合發芽勢、發芽率、根長、苗高、發芽指數和活力指數等指標，苜蓿耐鹽性由強到弱依次為：巨能2>WL414>巨能801>耐鹽之星>WL-SALT>中苜1號>中苜5號>賽迪10>KRIMA>BISTRA>3010>4030>601FY>Hunter River>SOCA>金皇后>皇后苜蓿>皇冠>苜蓿王>游客>中苜3號>中苜4號>L3003。

對于試驗中出現的矛盾結果，即同一指標分析相同品種得到的不同結果，在郭興燕等[26]研究中也存在，對于此結果產生的原因將在后續的工作中，通過生理生化等指標的測定和研究，進一步分析探討。對23個苜蓿材料種子萌發特性的研究表明，苜蓿屬植物種子具有一定的耐鹽性，但由于其受遺傳、環境等因素的影響，不同品種間的耐鹽性存在較大差異。對苜蓿耐鹽性的鑒定和評價應建立在生產實踐的基礎上，選擇科學的，具有普遍性、穩定性和適用性的耐鹽性鑒定方法，運用綜合的、全面的評價方法進行鑒定和評價。