蒽環類藥物的心臟毒性機制

秦 聰(綜述)，吳星恒(審校)

(南昌大學a.研究生院醫學部2014級; b.第一附屬醫院兒科，南昌330006)

蒽環類藥物的心臟毒性機制

秦 聰a(綜述)，吳星恒b(審校)

(南昌大學a.研究生院醫學部2014級; b.第一附屬醫院兒科，南昌330006)

蒽環類藥物(ANT)是應用最廣泛的抗腫瘤藥物之一，但由于其嚴重的心臟毒性，臨床應用受到限制。早期研究認為ANT的心臟毒性作用與氧化應激及鐵代謝失衡有關，新近的研究發現，ANT還可通過干擾基因的表達及加快細胞自噬導致心臟損傷，本文就氧化應激、鐵代謝失衡、細胞自噬、基因表達等方面，對ANT致心臟毒性機制進行綜述。

蒽環類藥物; 心臟毒性; 機制

蒽環類藥物(ANT)應用于臨床已達半世紀之久，被越來越多的化療方案采用以發揮其最大的抗腫瘤效應，成為現代腫瘤治療學的重大成就之一。近年來某些化療藥物逐漸被靶向治療所替代，而ANT在腫瘤聯合化療方案中的地位仍難以取代[1-3]。由于ANT嚴重的心臟毒性使其臨床應用受到了極大的限制，心臟毒性大小往往呈劑量相關性，與非蒽環類化療藥物聯合治療時，心臟毒性常常加重。ANT致心臟毒性作用可隨時發生，即使是緩解期的腫瘤患者也不能幸免[4-5]。關于ANT致心臟毒性機制，早期研究以氧化應激、鐵代謝失衡為主，近年來發現ANT致心臟毒性是多種機制共同作用的結果，并將研究重點轉移到基因表達層面。本文就幾種ANT致心臟毒性機制作一綜述。

1 ANT產生活性氧簇(ROS)與心肌損傷

ANT產生的ROS及有毒醛類物質對多種細胞及組織均有損害作用，為什么心臟對ANT的損傷最敏感呢？首先，由于心肌細胞缺乏抗氧化酶，因此抗氧化活性較其他組織、細胞弱。肝臟中過氧化氫酶的含量是心臟的150倍，超氧化物歧化酶的含量約為心臟的4倍[7]。Doroshow等[7]研究表明盡管正常肝臟和心臟所含谷胱甘肽過氧化物酶活性相同，但阿霉素作用后心臟的谷胱甘肽過氧化物酶卻更易受其影響致活性下降。實驗以遞增濃度的阿霉素(5、10、15 mg·kg-1)作用于小鼠，發現阿霉素劑量越高，小鼠心臟的谷胱甘肽過氧化物酶活性越低，心肌細胞損傷越嚴重；而心臟的超氧化物歧化酶、肝臟的超氧化物歧化酶以及肝臟的谷胱甘肽過氧化物酶活性受同一劑量的阿霉素影響不明顯。由此猜想，心臟對抗過氧化物損傷主要通過谷胱甘肽過氧化物酶作用，但其活性可受阿霉素的影響而降低，使心臟缺乏對抗氫過氧化損傷及脂質過氧化損傷的能力。其次，ANT與心肌細胞有高度親和力，Parker等[8]通過建立2H標記的心磷脂的陰離子型磷脂雙分子模型，在磁場存在的條件下，阿霉素與此模型結合可導致2H的分裂，以此來證實阿霉素與心磷脂的親和力，結果表明阿霉素對屬于陰離子型磷脂雙分子的心磷脂具有高度親和力。而動物體內的心磷脂大部分存在于線粒體細胞內膜及心肌中。同時心肌細胞本身也富含線粒體，線粒體占據心肌細胞內近50%的空間。另一方面，相較于肝臟線粒體，心肌細胞的線粒體可產生額外的NADH脫氫酶，循環生成更多ANT相關自由基參與氧化應激損傷[9-10]。

2 鐵代謝失調、ATP結合盒轉運蛋白B8(ABCB8)與心肌損傷

Ichikawa等[11]發現在培養的新生鼠心肌細胞中，阿霉素的作用可使線粒體內鐵含量顯著升高，ABCB8 mRNA及其蛋白質水平卻顯著下降。ABCB8屬于ABC蛋白家族中的一員，有研究[12-13]表明，ABCB8通過協調線粒體鐵的輸出對維持線粒體內鐵平衡及細胞質Fe/S蛋白成熟有重要作用。由此猜測，阿霉素致心肌細胞鐵失衡與其調節ABCB8有關。Ichikawa等[11]還發現在ABCB8 mRNA及蛋白質下調時，線粒體鐵轉運蛋白-2(一種參與線粒體內鐵輸入的蛋白)水平無明顯改變，但與鐵存儲有關的線粒體鐵蛋白及其mRNA水平顯著上升，說明阿霉素致心肌細胞鐵失衡是由于鐵的輸出受抑制而并非是鐵輸入的增加。離體實驗中，阿霉素作用于ABCB8表達下調的新生鼠心肌細胞，發現線粒體中的鐵水平明顯增高，而細胞核或者細胞質中的鐵含量無明顯改變，通過MTS分析及TUNEL法測定本組的心肌細胞死亡率也較阿霉素作用的普通新生鼠心肌細胞明顯升高。另一方面，使ABCB8基因過表達可抑制阿霉素所致心肌細胞線粒體鐵聚集并明顯減少心肌細胞死亡率，說明阿霉素致心臟損傷與其抑制ABCB8的表達進而影響心肌細胞的鐵代謝有關。

3 帶有caspase富集功能域的凋亡抑制因子(ARC)、MicroRNA-532-3p與心肌損傷

ARC最初是作為內源性細胞凋亡抑制因子被發現。它對內源性及外源性的細胞凋亡信號途徑均有對抗作用。ARC對于保持心臟生理功能也具有重要作用，在病理條件下，ARC下調可引起多種心臟疾病的發生，如心肌肥大、心力衰竭和心肌梗死。

Wang等[14]將阿霉素作用于離體的心肌細胞，發現不論是在ARC mRNA水平還是在其蛋白水平，數量均下調。阿霉素劑量為2 μmol·L-1時，線粒體開始分裂，心肌細胞死亡率逐漸增加，在這個過程中，Caspase-3的活性明顯增加。但阿霉素作用于可高表達ARC的心肌細胞時，線粒體分裂、心肌細胞凋亡及Caspase-3的活性均降低。小劑量阿霉素(0.2 μmol·L-1)作用于正常心肌細胞時，僅有一小部分心肌細胞發生線粒體分裂、細胞凋亡，而相同的小劑量阿霉素作用于敲除ARC基因的心肌細胞，線粒體分裂、細胞凋亡及Caspase-3的活性再次顯著增加。由此猜測ANT致心臟毒性可能與其下調ARC表達有關。

MicroRNA(miRNA)是一類內源性的具有調控功能的非編碼區的RNA，可通過控制mRNA自身的穩定及其翻譯過程對靶基因進行負性調節。miRNA也具有調節心臟功能的作用，例如控制心臟電信號的傳導、心肌細胞的收縮、心臟的生長及形態的改變等。Wang等[14]通過RNA雜交工程及即時定量聚合酶連鎖反應(qRT-PCR)研究ARC基因的3′非編碼區作用時發現，阿霉素作用使ARC表達下調時，一些miRNA數量增加，其中miRNA-532-3p數量增加明顯。進一步的熒光標記法證實miRNA-532-3p可通過作用于3′非編碼區來調節ARC的生成。單使心肌細胞的miRNA-532-3p擴增對線粒體的裂解及凋亡無明顯影響，但加入阿霉素后，即使是小劑量(0.2 μmol·L-1)，miRNA-532-3p擴增的心肌細胞也會出現明顯增多的線粒體裂解及心肌細胞凋亡，說明阿霉素通過miRNA-532-3p下調ARC水平，使線粒體裂解增加進而促進心肌細胞凋亡。因為ARC在某些腫瘤細胞中也可高表達，阿霉素使腫瘤細胞中ARC表達下調的過程中是否也有miRNA-532-3p參與？在一些腫瘤細胞中(例如Hela、SGC-7901、SW-480、HepG-2)，miRNA-532-3p表達水平較心肌細胞低。在Hela、SGC-7901、SW-480、HepG-2腫瘤細胞株中加入阿霉素，并未發現miRNA-532-3p的表達水平有明顯改變。敲除miRNA-532-3p基因的Hela、SGC-7901、SW-480、HepG-2腫瘤細胞株在作用于阿霉素后，其細胞凋亡情況較未敲除該基因的腫瘤細胞株無明顯差異。由此可見，miRNA-532-3p并未參與阿霉素的抗腫瘤過程，僅在阿霉素致心臟毒性中發揮作用。這為研究既不干擾阿霉素抗腫瘤作用,又可保護心臟的抗心肌損傷藥物提供了方向。

4 心肌細胞自噬

ANT引起的心臟毒性涉及多種不同的蛋白質消耗，包括細胞自噬在內的多種蛋白降解系統參與了ANT相關心臟毒性的發生。當細胞自噬發生時，由自噬相關基因ATG8編碼的微管相關蛋白質輕鏈3(LC3)酶解掉一小段多肽，使LC3-I(18 000)轉變為LC3-Ⅱ(16 000)，并進入自噬小體(AVs)形成其中一部分。因此LC3-Ⅱ的水平在一定程度上與自噬小體的數量正相關。為了解阿霉素對心肌細胞的致自噬作用，Kobayashi等[15]將心肌細胞培養在加有1%牛血清的DMEM培養基中，使用阿霉素(1 μmol·L-1)作用18 h后測定LC3-Ⅱ的水平。蛋白質印跡實驗(WB)表明，阿霉素作用后LC3-Ⅱ水平顯著升高。但是LC3-Ⅱ及AVs的水平會隨著自噬小體的形成和降解發生變化，自噬流可以反映自噬小體轉移至溶酶體的量及在其中降解的程度，進一步反映細胞自噬的活性。該實驗通過比較溶酶體抑制劑存在與否的條件下AVs或LC3-Ⅱ的含量變化來反映自噬流，為了解阿霉素引起LC3-Ⅱ的聚集是因為自噬流還是因為蛋白降解系統自身功能失調，根據是否加入溶酶體抑制劑巴弗洛霉素A1(BFAA1)將阿霉素作用的心肌細胞再次分組。結果表明，加入BFAA1的阿霉素作用組較未加入BFAA1的阿霉素作用組，LC3-Ⅱ增加更顯著，說明阿霉素可通過加快心肌細胞自噬引起心臟損傷。

5 心肌錨定重復序列蛋白(CARP)、轉錄因子GATA4與心肌損傷

CARP是經典的肌肉序列蛋白家族中的一類。在培養的大鼠心肌細胞中使用干擾性小核糖核酸(siRNA)抑制CARPmRNA轉錄，發現CARP減少的同時絲狀肌動蛋白及肌間蛋白條紋數量均急劇下降，大量肌纖維被破壞致顯著的肌節紊亂[15]。CARP對阿霉素極為敏感，Chen等[16]將阿霉素作用于體外培養的小鼠心肌細胞，發現即使0.5 μmol·L-1劑量的阿霉素足以對CARP的表達產生顯著的抑制。

GATA4屬于鋅指結構轉錄因子GATA家族中的一員。GATA家族中的6個成員通過識別相應基因片段并與之結合起到調節目的基因轉錄的作用。GATA1、2、3在調節血細胞及血管內皮細胞基因轉錄中起到重要作用，GATA4、5、6在新生的心臟中表達，而GATA4在成熟的心臟中有較大的活性。GATA4作為重要的轉錄調節因子，對心肌細胞的分化、心肌肌節的合成及心肌細胞的存活起著重要的作用，但阿霉素可下調GATA4連接活性，引起心肌纖維破壞、肌節紊亂，進而出現心肌收縮功能減弱影響心臟功能[17]。

Park等[18]發現柔紅霉素(DNR)可以抑制小鼠心肌細胞GATA4 mRNA的表達且DNR的這種作用依賴于p53基因，使用抑制劑-α(一種p53的抑制劑)可抑制DNR對GATA4的下調作用。

Chen等[16]在小鼠心肌細胞內使用siRNA敲除GATA4基因，CARP基因啟動子的活性及CARP蛋白數量均下降，致大量心肌細胞肌節紊亂，使用載有GATA4基因的腺病毒轉染一部分敲除GATA4基因的小鼠心肌細胞使GATA4基因過表達，24 h后將相同劑量阿霉素分別作用于GATA4過表達組及GATA4無表達組，發現較GATA4無表達組，GATA4過表達組的CARP水平明顯增高，免疫組織化學顯示心肌細胞M線被很好的保留，證明GATA4過表達可抑制阿霉素致心肌肌節紊亂并猜測ANT可通過下調GATA4致CARP數量減少，進而引起心肌細胞肌節紊亂。

研究發現GATA4與ANT致心肌細胞自噬也有關系。Kobayashi等[15]將阿霉素(1 μmol·L-1)作用于培養的新生鼠心肌細胞，發現LC3-Ⅱ在加入阿霉素的1～3 h就開始顯著增加，隨著阿霉素的加入，LC3-Ⅱ的數量一直持續上升，相反，GATA4的數量在最初作用的1～3 h減少最顯著，之后持續下降。進一步研究，使心肌細胞GATA4基因過表達，在阿霉素作用下，LC3-Ⅱ數量下降，加入BFAA1的心肌細胞組也可見LC3-Ⅱ的聚集明顯減少。當敲除心肌細胞GATA4基因后，可發現阿霉素致心肌細胞自噬流顯著增加。另一方面，當GATA4過表達使心肌細胞自噬流減少時，Bcl-2蛋白顯著增加；GATA4基因敲除后，心肌細胞自噬流顯著增加，但近90%的Bcl-2蛋白隨之減少。由此猜測GATA4參與的ANT致心肌細胞自噬可能是通過調節Bcl-2的表達起作用。

6 結語

ANT致心臟毒性是由多種機制共同作用引起。除了引起氧化應激及鐵代謝失衡外，ANT可通過加快心肌細胞自噬作用并影響多種基因的表達，使其編碼的功能蛋白發生改變從而引起心肌細胞的功能失調，最終導致心肌細胞死亡，造成心臟不可逆的損傷。

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(責任編輯：羅芳)

2017-02-12

R96

A

1009-8194(2017)06-0104-02

10.13764/j.cnki.lcsy.2017.06.041