乳腺癌細胞ret基因轉錄水平的表達及其與PI3KAktmTOR信號通路相關因子的關系

楊 滿，崔軍威，程 苒，韋 偉

(北京大學深圳醫院乳甲外科，廣東 深圳 518036)

乳腺癌細胞ret基因轉錄水平的表達及其與PI3KAktmTOR信號通路相關因子的關系

楊 滿，崔軍威，程 苒，韋 偉

(北京大學深圳醫院乳甲外科，廣東 深圳 518036)

目的 探討乳腺癌細胞ret基因轉錄水平的表達及其與PI3KAktmTOR信號通路相關因子的關系。方法以乳腺癌細胞為研究對象，采用熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測細胞中RET、PI3K、mTOR和AKT mRNA表達量，構建合成ret shRNA慢病毒載體，轉染乳腺癌細胞，再次采用RT-PCR檢測細胞中RET、PI3K、mTOR和AKT mRNA表達量。比較轉染前后細胞中RET、PI3K、mTOR和AKT mRNA表達量，并采用Pearson線性相關分析法分析其細胞中RET mRNA表達量與其PI3K、mTOR和AKT mRNA表達量的關系。結果 轉染前細胞中RET、PI3K、mTOR和AKT mRNA表達量分別為0.851±0.126、0.872±0.126、0.845±0.087和0.769±0.355，均分別高于轉染后的0.108±0.023、0.113±0.022、0.098±0.022和0.072±0.013(P<0.05)。Pearson線性相關分析結果顯示，細胞中RET mRNA表達量與其PI3K、mTOR和AKT mRNA表達量均呈正相關(r=0.877、0.852、0.863,P<0.05)。結論 乳腺癌細胞ret基因轉錄水平較高且與PI3KAktmTOR信號通路相關因子密切相關，可能通過調控PI3KAktmTOR信號通路而影響乳腺癌的發生發展，可能作為乳腺癌治療的靶基因之一。

乳腺癌； ret基因； PI3KAktmTOR信號通路； 關系

乳腺癌是常見惡性腫瘤疾病，其惡性程度高，病情進展快，患者預后情況差，急需改善[1-2]。近年來乳腺癌的診治水平取得了較大進展，然而患者的預后情況仍不容樂觀。因此，改善乳腺癌治療效果是目前急需解決的醫療難題。近年來基因靶向治療成為乳腺癌等癌癥治療的熱門方向[3]。在癌癥相關基因中，原癌基因RET發揮著重要作用，其過量表達與甲狀腺癌等的發生發展密切相關[4]。因此，RET基因亦可能與乳腺癌發生發展相關。而乳腺癌的發生發展受到PI3KAktmTOR信號通路等的影響[5]。因此，本研究假設RET基因可能與乳腺癌PI3KAktmTOR信號通路相關，并進行了實驗證實，將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 細胞來源

2015年9月至2016年6月于北京大學深圳醫院行手術治療的60例乳腺癌患者癌組織細胞，為新鮮組織，均經病理學檢查診斷證實為原發性乳腺癌，腺癌21例，浸潤性導管癌39例，年齡28～78(53.32±9.76)歲，PTNM分期為I期20例，Ⅱ期37例，Ⅲ期3例，無遠處轉移。實驗經本院倫理學委員會審核批準，且相關患者均簽署知情同意書。

1.2 實驗時間和地點

于2015年9月至2016年6月在北京大學香港科技大學醫學中心實驗室完成。

1.3 試劑和儀器

恒溫箱(江蘇佳美儀器有限公司)，離心管、玻璃瓶、吸管、試管等(廣東東普醫療科技有限公司)，離心機(德國艾本德公司)，DMEM/F12培養基和胎牛血清(美國Gibco公司)，RNA提取試劑盒(德國Qiagen公司)，逆轉錄試劑盒、cDNA合成試劑盒(美國Promega公司)，實時定量PCR試劑盒和SYBR Premix EX Taq(日本Takara公司)，細胞培養箱、細胞培養板(美國SHELLAB公司)，熒光顯微鏡(日本Nikon公司)，離心管、玻璃瓶、吸管、試管等(廣東東普醫療科技有限公司)，細胞培養箱、細胞培養板、醫用恒溫水浴箱(美國SHELLAB公司)，低溫冰箱(青島海爾公司)，引物(上海生物工程有限公司)，ABI PRISM 377測序儀(美國Perkin-Elmer公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 細胞培養

37 ℃水浴箱中使細胞融化，以3500 r·min-1轉速離心5 min后棄去上清液，加入培養皿中培養，在37 ℃和5%CO2環境中培養，培養基為含10%胎牛血清的高糖型DMEM培養基，培養細胞至80%融合，采用0.25%的胰酶進行消化并按1：3～1：5的比率行傳代培養，并取對數生長期細胞進行相關實驗研究。

1.4.2 器具處理

所有實驗器具均在使用前1 h行紫外線照射1 h，并在各器皿上貼上相應的標簽以免實驗操作中出現失誤。

1.4.3 指標檢測

采用熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測細胞中RET、PI3K、mTOR和AKT mRNA表達量，常規提取總RNA，采用逆轉錄試劑盒行逆轉錄反應，按照試劑盒說明進引導進行操作，將cDNA冷藏于-20 ℃低溫冰箱中備用。實行RT-PCR檢測，操作亦按照相關試劑盒說明書進行，反應條件分別為先于94 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃反應60 s，共進行40個循環，72 ℃延伸5 min，4 ℃反應5 min。進行3次獨立重復檢測。結果分析采用7500SDS v1.3.1軟件操作，以18srRNA為內參，所得數據采用2-ΔΔCt公式進行分析。

1.4.4 含綠色熒光蛋白(GFP)慢病毒顆粒構建

化學合成ret基因的shRNA序列(5′-CCTCGGTCCCAGCCTAAGGTCAAT-3′)，將實驗合成的ret shRNA序列插入到GFP慢病毒顆粒中，構建ret shRNA慢病毒載體。

1.4.5 ret shRNA慢病毒載體轉染

取對數生長期人乳腺癌細胞，顯微鏡下觀察其生長情況并取生長狀態良好的人乳腺癌細胞平鋪在6孔板中，培養細胞至80%融合，各添加1 μL的ret shRNA慢病毒載體，3500 r·min-1和2 cm離心轉染30 min，轉染后培養1 d。

轉染后培養1 d后再次行RET、PI3K、mTOR和AKT mRNA表達量的檢測，具體檢測方法同1.4.3。

1.5 統計學方法

采用SPSS19.0軟件建立數據庫并行統計學分析，其中計量資料均符合正態分布，采用兩獨立樣本均數t檢驗進行比較，采用Pearson線性相關分析法分析其細胞中RET mRNA表達量與其PI3K、mTOR和AKT mRNA表達量的關系，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 轉染前后的RET mRNA相對表達量比較

經核苷酸序列確定FAK shRNA序列成功插入GFP慢病毒顆粒，與轉染前比較，轉染后RET mRNA相對表達量明顯降低，RET shRNA慢病毒載體可有效抑制RET mRNA表達，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

2.2 轉染前后的PI3K、mTOR和 AKT mRNA相對表達量比較

與轉染前比較，轉染后PI3K、mTOR和 AKT mRNA相對表達量明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

時間nRETmRNA相對表達量PI3KmRNA相對表達量mTORmRNA相對表達量AKTmRNA相對表達量轉染前600.851±0.1260.872±0.1260.845±0.0870.769±0.055轉染后600.108±0.0230.113±0.0220.098±0.0220.072±0.013t44.93145.96564.47995.530P<0.05<0.05<0.05<0.05

2.3 乳腺癌細胞中RET mRNA表達量與其PI3K、mTOR和 AKT mRNA表達量的關系分析

Pearson線性相關分析結果顯示，細胞中RET mRNA表達量與其PI3K、mTOR和 AKT mRNA表達量均呈正相關(r=0.877、0.852、0.863,P<0.05)，見封四圖1—3。

3 討論

近年來隨著生活方式、飲食結構和居住環境等的改變，各類癌癥的發生不斷增加。其中乳腺癌為臨床常見癌癥，是可嚴重威脅患者生命安全的惡性腫瘤疾病[6]。因此，對乳腺癌病情和預后的改善十分重要。乳腺癌的治療方法多樣，常采用的治療方法有手術治療、化療、免疫治療等，但各類治療方法的預后情況仍較差[7]。改善乳腺癌療效和預后的問題亟待解決。乳腺癌的發生發展涉及到原癌基因的活化以及抑癌基因的失活引發的相關蛋白合成障礙和細胞信號傳導障礙，細胞生物學行為改變等[8]。RET基因為原癌基因，與乳腺癌密切相關[9]。而胡海燕[10]的畢業論文研究了青海地區乳腺癌、甲狀腺多原發癌患者癌組織中RET基因的轉錄表達水平，其研究結果顯示，青海地區乳腺癌、甲狀腺多原發癌的癌組織中RET基因的轉錄表達水平較高，RET基因的過量表達與青海地區乳腺癌、甲狀腺多原發癌的發生相關。因此，RET基因亦可能與乳腺癌發生發展相關。

乳腺癌的發生發展涉及多個信號通路，其中PI3KAktmTOR信號通路是乳腺癌細胞內信號傳導的重要途徑，其異常激活與乳腺癌的發生發展密切相關，可通過抑制腫瘤細胞的凋亡、促進腫瘤細胞生長、調節腫瘤細胞周期、促進腫瘤新生血管形成而促進侵襲轉移等多種途徑影響乳腺癌的發生發展以及臨床轉歸，而抑制PI3KAktmTOR信號通路的活性對乳腺癌治療具有重要意義[11-12]。近年來基因靶向治療在乳腺癌的治療研究較多[13]。本研究假設RET基因可能通過活化PI3KAktmTOR信號通路影響乳腺癌的發生發展，抑制RET基因可能抑制PI3KAktmTOR信號通路而達到抑制乳腺癌發展的目的。因此，本研究設計實驗，以乳腺癌細胞為研究對象，構建合成病毒載體及RET ShRNA，轉染乳腺癌細胞，采用熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測轉染前后細胞中RET、PI3K、mTOR和AKT mRNA表達量，比較了轉染前后細胞中RET、PI3K、mTOR和AKT mRNA表達量并分析了其細胞中RET mRNA表達量與其PI3K、mTOR和AKT mRNA表達量的關系，旨在為尋找乳腺癌基因靶向治療的新的有效治療基因提供依據。

本研究結果顯示，ret shRNA慢病毒載體轉染前乳腺癌細胞中RET、PI3K、mTOR和AKT mRNA表達量均較高，均在0.79以上，提示RET基因和PI3KAktmTOR信號通路均與乳腺癌的發生相關。而ret shRNA慢病毒載體轉染后的RET、PI3K、mTOR和AKT mRNA表達量明顯降低，均降低到0.1左右，提示RET mRNA表達量可能與PI3K、mTOR和AKT mRNA表達量有關。進一步的Pearson線性相關分析結果顯示，隨著乳腺癌細胞中RET mRNA表達量的增加，其PI3K、mTOR和AKT mRNA表達量亦增加，乳腺癌細胞中RET mRNA表達量與其PI3K、mTOR和AKT mRNA表達量均呈正相關。RET與乳腺癌的發生發展密切相關，其在乳腺癌中的作用可能是通過激活PI3KAktmTOR信號通路而促進乳腺癌發生發展，而抑制RET基因的表達可抑制PI3KAktmTOR信號通路活性，抑制乳腺癌進一步發展，改善乳腺癌病情和預后。RET基因可能作為乳腺癌靶向治療的靶基因之一，靶向抑制RET基因表達可能是乳腺癌治療的有效方法之一

綜上所述，乳腺癌細胞ret基因與乳腺癌發生發展和PI3KAktmTOR信號通路均相關，可能通過調控PI3KAktmTOR信號通路而影響乳腺癌發展，因此，靶向抑制RET基因表達可能作為乳腺癌靶向治療的方法之一。

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(責任編輯：羅芳)

RET mRNA相對表達量

RET mRNA相對表達量

RET mRNA相對表達量

2017-01-14

R737.9

A

1009-8194(2017)06-0043-03

10.13764/j.cnki.lcsy.2017.06.016