老年漢族人群KL基因G-395A多態性與冠狀動脈粥樣硬化性心臟病及胱抑素C水平的相關性分析

劉 瑋,張韶英,徐慧敏,管斯斯

(湖北省武漢市中心醫院老年科 430014)

老年漢族人群KL基因G-395A多態性與冠狀動脈粥樣硬化性心臟病及胱抑素C水平的相關性分析

劉 瑋,張韶英△,徐慧敏,管斯斯

(湖北省武漢市中心醫院老年科 430014)

目的 研究華中地區老年漢族人群Klotho(KL) 基因的G-395A位點多態性與冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(以下簡稱冠心病)及胱抑素C(Cys-C)水平的相關性。方法 選取該院老年科(年齡大于或等于60歲)漢族冠心病患者138例(冠心病組)，無冠心病老年人140例(對照組)作為研究對象，用TaqMan基因探針法分別檢測兩組KL基因G-395A位點的基因型，并分析該位點基因多態性與冠心病及血清Cys-C水平的相關性。結果 與對照組相比，冠心病組KL基因的G-395A位點GG基因型頻率明顯增高(P<0.05)，AA基因型和AG基因型的頻率差異無統計學意義(P>0.05)。無論在對照組還是冠心病組，GG基因型的人Cys-C水平均高于AA和AG基因型。結論 在華中地區老年漢族人群中，KL基因的G-395A位點為GG基因型的人患冠心病的風險較高。KL基因G-395A位點的基因突變可能通過影響血Cys-C水平，抑制動脈粥樣硬化的發生發展。

Klotho基因；多態性,單核苷酸；半胱氨酸蛋白酶抑制劑；冠心病；老年人

KL基因是于1997年在小鼠體內被發現的能抑制衰老及各種衰老相關表現(如壽命縮短、骨質疏松、動脈硬化、軟組織鈣化、皮膚萎縮、肺氣腫等)的基因[1]。研究表明，KL基因敲除(KL-/-)的小鼠在出生不久后就開始出現動脈粥樣硬化的征象(如內膜增厚、主動脈鈣化等)，并隨著增齡逐漸加重[1]。而把外源性的KL cDNA轉導入KL-/-的小鼠體內后，其動脈粥樣硬化的程度能夠得到顯著的改善[2]。上述研究成果表明，KL基因與動脈粥樣硬化密切相關。然而，KL基因參與動脈粥樣硬化發生發展機制尚不明確。近年來大量研究發現，血清胱抑素C(cystaint,Cys-C)參與了炎性反應及動脈粥樣硬化的進程，與冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(以下簡稱冠心病)的發生、發展有十分密切的關系[3-4]。本研究擬通過對KL基因G-395A多態性位點進行基因型分析，探討KL基因的G-395A位點多態性與華中地區老年漢族人群冠心病發病的相關性，同時通過對血清Cys-C水平的檢測，探討KL基因多態性參與冠心病發生發展的相關機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2012年3-11月在本院老年科病房住院的患者，隨機選取老年(≥60歲)住院患者278例(其中男136 例，女142 例，年齡60～97歲)。研究納入標準：年齡大于或等于60歲，無血緣相關關系的、愿意參加項目研究者。本研究符合人體試驗倫理學標準，并得到倫理委員會的批準。所有參加的研究對象均簽署知情同意書。病例分組：根據冠狀動脈造影和(或)冠狀動脈非創傷性血管成像技術(CTA)結果將入選對象分為冠心病組(138例)和對照組(無冠心病)。冠心病診斷標準按照Judkin′s法：根據1975年美國心臟病學會分段分類法的標準將冠狀動脈進行分段，至少在兩個以上的X線片投影位置能看到冠狀動脈的分支段狹窄大于或等于50%的可以診斷為冠心病。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 所有對象于清晨空腹抽取肘正中靜脈血5 mL,乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝,用DNA抽提試劑盒提取DNA(中國大連寶生物工程技術有限公司)。

1.2.2 KL基因G-395A 位點單核苷酸多態性(SNP)檢測 通過美國國家生物信息中心的Gene-Bank獲取KL基因序列及G-395A位點的SNP 信息(rs1207568)。由美國ABI公司合成TaqMan 引物和探針，采用2×TaqMan Universal PCR Master Mix試劑盒(ABI公司，貨號4351379，批號P130715-008E09)進行試驗，在熒光定量PCR儀(ABI Stepone plus型)上進行擴增。探針1:(VIC)-AGT CGG GAA AAG T-(MGB)；探針2:(FAM)-CAA GTC GGG GAA AG-(MGB)；上游引物：5′-TAG GGC CCG GCA GGA T-3＇；下游引物：5′-CCT GGA GCG GCT TCG TC-3＇；反應體系為：40×引物和TaqMan探針混合物0.5 μL，2×TaqMan Universal PCR Master Mix 10 μL，模板DNA 2.0 μL，ddH2O 7.5 μL，共20 μL反應體系。PCR反應條件如下:95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火和延伸各1 min，共40個循環。

1.2.3 血清Cys-C水平檢測 對所有入選的病例進行清晨空腹肘正中靜脈采血，使用北京利德曼生化股份有限公司提供的血清測定試劑盒,由專人使用北京利德曼生化分析儀采用顆粒增強散射免疫比濁法測定血清中Cys-C水平。血清中Cys-C水平參考范圍為0.63～1.25 mg/L。

1.2.4 一般資料及生化指標錄入 記錄入選病例的年齡，吸煙史、體質量指數(BMI)、血壓、清晨空腹血糖、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。(1)每天吸煙超過1支，吸煙時間超過1年的記錄為有吸煙史；(2)已經接受降壓藥物治療，或者非同日兩次以上測量收縮壓(SBP)≥140 mm Hg或舒張壓(DBP)≥90 mm Hg記錄為高血壓；(3)已經接受降糖藥物治療或者空腹血糖大于或等于7.0 mmol/L、或者餐后血糖大于或等于11.1 mmol/L記錄為糖尿病；(4)已經接受降脂藥物治療或TC>5.7 mmol/L或TG>2.3 mmol/L或LDL>3.7 mmol/L均記錄為高血脂。

2 結 果

2.1 冠心病組與對照組的臨床資料分析 冠心病組和對照組的年齡、DBP、TC、TG、BMI差異無統計學意義(P>0.05)；冠心病組血糖、SBP、LDL、HDL水平、男性比例及吸煙比例明顯高于對照組，而HDL水平明顯低于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1。

2.2 冠心病組與對照組的KL基因G-395A位點多態性分布 KL基因型的分布經χ2檢驗符合HaIdy-Weinberg平衡定律，具有群體代表性。與對照組比較，冠心病組GG基因型明顯升高，AA基因型及AG基因型與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)；G等位基因頻率明顯升高，A等位基因頻率明顯降低。見表2。

2.3 KL基因G-395A位點GG基因型與老年冠心病的相關性 在調整年齡、性別、吸煙史、高血壓、高血脂和高血糖等因素并經多元Logistic回歸分析后，GG基因型與老年冠心病存在相關性，GG基因型為老年冠心病的獨立危險因子，見表3。

2.4 KL基因G-395A位點多態性與血清Cys-C的關系 無論在對照組還是冠心病組，GG基因型的Cys-C水平均高于AA基因型和AG基因型。AA基因型和AG基因型的Cys-C水平差異無統計學意義(P>0.05)，見表4。

表1 兩組基本資料比較

表2 KL基因 G-395A 的多態性分布[n(%)]

表3 多元Logistic回歸分析KL基因G-395A位點GG基因型與老年冠心病的關系

表4 KL基因 G-395A 多態性與Cys-C水平的相關性

a：P< 0.05，與同組GG基因型比較比較

3 討 論

研究證實，人類KL基因G-395A位點的多態性與心源性腦卒中、冠心病、原發性高血壓等心血管系統疾病關系密切[5-7]。然而，國內外研究對KL基因G-395A位點的多態性與冠心病的相關性有不同的結論。Rhee等[7]發現在韓國60歲以上的人群中，KL基因G-395A位點A等位基因對冠心病具有保護作用。而在Imamura等[5]對日本人群KL基因G-395A位點多態性的研究中發現，A等位基因攜帶者其冠心病患病率較高。國內在對重慶地區的漢族人群G-395A位點多態性的研究中，發現A等位基因攜帶頻率與動脈硬化呈負相關[8]。因此推測上述不同的研究結論產生的可能原因為KL基因G-395A位點多態性與冠心病的關系可能存在著某些種族、地域和年齡效應，且與樣本量的大小有關。在本研究中發現，在華中地區60歲以上的老年漢族人群中，A等位基因攜帶者其冠心病患病率較低，這與韓國和重慶地區的相關研究結果相符[9]。在調整年齡、性別、吸煙史、高血壓、高血脂和高血糖等傳統的冠心病危險因素并經多元Logistic回歸分析后發現，GG基因型與老年冠心病存在相關性，GG基因型為老年冠心病的獨立危險因子。本研究為探討KL基因多態性與冠心病的相關性補充了一部分華中地區老年人群的數據庫信息。然而，本研究僅限于單位點、單種族、單年齡段且樣本量有限，KL基因多態性與冠心病的關系有待于多位點突變的發現和多地域、多民族廣泛深入的協同研究。

目前認為冠狀動脈粥樣斑塊的形成和發展過程與細胞外基質(ECM)的重構及冠狀動脈血管壁重塑有密切聯系[10-11]。Cys-C是半胱氨酸蛋白酶抑制劑超家族2中的成員之一，Cys-C通過調節半胱氨酸蛋白酶活性，參與ECM產生和降解的動態平衡，還可能通過影響粒細胞的吞噬與趨化功能，參與炎癥過程，促進動脈粥樣硬化的發生發展[12-14]，是預測冠心病患者發生心臟事件的獨立危險因子。本研究發現，在華中地區60歲以上的老年人群中，KL基因G-395A位點野生型攜帶者(GG基因型)血清Cys-C水平無論在對照組和冠心病組均明顯高于突變型攜帶者(GA基因型和AA基因型)。基因發生突變可能導致轉錄決定蛋白質合成的氨基酸序列的改變，引起Cys-C合成和分泌量的降低，對半胱氨酸蛋白酶活性的抑制也可能減弱，減輕ECM的沉積及炎性反應，從而延緩冠狀動脈粥樣硬化的發生發展。KL基因G-395A位點的G-A突變可能通過降低血Cys-C水平，減輕ECM的重構及冠狀動脈血管壁重塑，從而抑制冠心病的發生發展。

綜上所述，筆者認為在華中地區老年漢族人群中，KL基因G-395A位點多態性與冠心病的發病相關，A等位基因攜帶者其冠心病患病率較低，GG基因型為老年冠心病的獨立危險因子。KL基因G-395A位點的基因突變可能通過影響血Cys-C水平，抑制冠狀動脈粥樣硬化的發生、發展。

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Association of KL gene G-395A polymorphisms with coronary heart disease and serum cystatin C level in the elderly Chinese Han population in central China*

LiuWei，ZhangShaoying△，XuHuimin，GuanSisi

(DepartmentofGeriatrics，theCentralHospitalofWuhancity,Wuhan,Hubei430014,China)

Objective To investigate the single nucleotide polymorphism at G-395A site of the Klotho (KL) gene and to analyze its correlation with the coronary heart disease(CHD) and serum Cystatin C(Cys-C) level in the elderly Chinese Han population in central China.Methods A case-control study was conducted in 278 elderly Chinese Han population in this department,who were divided into CHD group(138 cases)and control group(140 cases) according to bear angiography coronary or not.G-395A polymorphism of KL gene was determined by TaqMan Gene probe method,and the relationship between G-395A polymorphism and coronary heart disease and serum Cys-C level was analyzed.Results Compared with the control group,the frequency of GG genotype of G-395A in CHD group was significantly higher,and the frequency of AA genotype and AG genotype was not statistically significant.The levels of Cys-C in the GG genotype were higher than those in the AA and AG genotypes both in the control group and coronary heart disease group.Conclusion In the elderly Han population in central China,the risk of suffering coronary heart disease is higher among the GG genotype of the G-395A locus of the KL gene.KL gene G-395A site gene mutation may affect the development of atherosclerosis by affecting blood Cys-C levels.

Klotho gene；polymorphism,single nucleotide；cysteine proteinase inhibitors；Atherosclerosis；aged

湖北省武漢市科技局資助課題(201260523187-4)；湖北省武漢市衛生和計劃生育委員會科研計劃資助項目(WX12C04)。

劉瑋(1981-)，副主任醫師，博士，主要從事衰老及動脈粥樣硬化機制研究。

△通信作者，E-mail：5622788@qq.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.23.012

R543．3

A

1671-8348(2017)23-3206-03

2017-01-24

2017-03-15)

論著·臨床研究