膜聯蛋白Ⅱ、乙酰肝素酶在中早期非小細胞肺癌中的表達及意義

王彥剛，汲廣徐，殷學富，王 磊

(山東省臨沂市莒南縣人民醫院胸外科 276600)

膜聯蛋白Ⅱ、乙酰肝素酶在中早期非小細胞肺癌中的表達及意義

王彥剛，汲廣徐，殷學富，王 磊△

(山東省臨沂市莒南縣人民醫院胸外科 276600)

目的 探討膜聯蛋白Ⅱ(Annexin Ⅱ)、乙酰肝素酶(HPA)在中早期非小細胞肺癌(NSCLC)中的表達情況及臨床意義。方法 收集2011年1月至2013年1月該院收治的100例中早期NSCLC患者，采用開胸肺葉切除術進行手術治療，檢測所有患者NSCLC組織及癌旁正常組織中Annexin Ⅱ、HPA的表達情況，采用SYBR GreenⅠ實時熒光定量逆轉錄PCR檢測HPA mRNA及Annexin Ⅱ在患者NSCLC組織和癌旁正常組織中的表達水平，并比較術后復發率及3年生存率。結果 在NSCLC癌組織和癌旁正常肺組織中均檢測到HPA mRNA及Annexin Ⅱ的表達。HPA mRNA及Annexin Ⅱ在NSCLC組織中的表達水平明顯高于癌旁正常肺組織，差異均有統計學意義(均P<0.05)。Annexin Ⅱ和HPA的高表達與腫瘤病理類型、腫瘤分期和淋巴結轉移均有關(均P<0.05)，與患者年齡、性別無關(均P>0.05)。Annexin Ⅱ、HPA的表達與肺癌的復發率及患者3年生存率存在性相關。結論 Annexin Ⅱ、HPA在中早期NSCLC中高表達，其可以作為NSCLC預后評價的指標。

癌,非小細胞肺；生存率；膜聯蛋白Ⅱ；乙酰肝素酶;預后

非小細胞肺癌(NSCLC)是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，其發病率與病死率分別居各類惡性腫瘤的第2位和第3位[1]。對于中早期肺癌患者，手術無疑是目前最理想的治療措施。Li等[2]對NSCLC患者進行回顧性分析，結果顯示在中早期行手術切除的患者，其3年生存率為75%，而單純放化療或姑息治療的患者3年生存率僅為48%。

膜聯蛋白Ⅱ(Annexin Ⅱ)是近來年發現的一種早期肺癌診斷的腫瘤標記物，其在肺癌的發生發展及轉移侵襲中發揮著重要作用。國外亦有研究證實,Annexin Ⅱ可以作為肺癌療效評估的指標之一[3]。乙酰肝素酶(HPA)是目前發現的生物體內惟一可以降解硫酸乙酰肝素活性的葡萄糖醛酸內切酶，通過釋放個性化肝素結合型的生長因子誘導血管的生成，從而為惡性腫瘤的轉移創造條件[4]。

本研究對醫院收治的中早期NSCLC患者均進行開胸肺葉切除術，并進一步檢查肺組織Annexin Ⅱ及HPA水平，旨在為中早期NSCLC的手術治療及預后指標的選擇提供參考，現將研究成果總結如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究經醫院倫理委員會審核批準，選擇2011年1月至2013年1月本院收治的100例中早期NSCLC患者作為研究對象，其中男52例，女48例，年齡25～78歲，平均(61.3±4.1)歲；腺癌37例，鱗癌51例，腺鱗癌12例；病變部位在右肺上葉21例，右肺中下葉34例，左肺上葉13例，左肺下葉32例；瘤最大徑0.7～3.8 cm，平均(2.3±0.3)cm；其中臨床分期Ⅰb期24例，Ⅱa期54例，Ⅱb期22例。(1)納入標準：①術前超聲、CT等檢查及術后病理切片證實為NSCLC；②按照美國癌癥聯合委員會[5](American Joint Committeeon Cancer,AJCC)NSCLC分期標準均為Ⅰ～Ⅱ期；③術前卡氏評分大于或等于60分；④患者及家屬獲知手術方案，并簽署知情同意書。(2)排除標準：①病理證實為腺樣囊性癌、黏液表皮樣癌或類癌者；②既往接受過放療、化療或手術治療者；③合并有其他惡性腫瘤或遠處轉移者；④凝血功能異常、心肺功能不全或身體狀況無法耐受手術者。

1.2 方法 鼠抗人Annexin Ⅱ抗體購自武漢博士德公司，免疫組織化學試劑盒購自北京中杉金橋生物公司，HPA ELISA試劑盒購自BD公司。按照S-P法進行免疫組織化學染色；染色前組織標本用微波高溫抗原修復，滴加兔抗人Annexin Ⅱ一抗(1∶1 500)4 ℃孵育過夜，PBS沖洗3次，再滴加羊抗兔IgG二抗37 ℃孵育過夜，DAB顯色，蘇木素復染，酸性乙醇梯度洗脫，中性樹膠封片。對于HPA的測定步驟按照ELISA試劑盒說明書進行。采用SYBR GreenⅠ實時熒光定量逆轉錄PCR檢測HPA mRNA及Annexin Ⅱ mRNA在患者NSCLC組織和癌旁正常肺組織中的表達水平。

1.3 結果判定標準 免疫組織化學：顯微鏡下觀察，以細胞染色呈棕黃色，且染色強度明顯高于背景色判為陽性，每張切片隨機觀察10個400倍視野。按照染色強度計分，0分：無染色；1分：淡黃色；2分：棕黃色；3分：棕褐色。按照染色面積計分，0分：細胞染色面積小于5%；1分：細胞染色面積5%～25%；2分：細胞染色面積26%～50%；3分：細胞染色面積大于50%[6-7]。以兩種計分結果乘積作為最終得分，參考標準：0～1分判為陰性(-)；2～3分判為弱陽性(+)；4～5分判為中等陽性(++)；≥6分判為強陽性(+++)；弱陽性、中等陽性、強陽性均為陽性表達。

1.4 隨訪 對所有患者均進行3年隨訪，隨訪截止日期為2016年2月，隨訪采取門診復查、電話回訪等方式，起始日期以術后第2天開始計算，記錄兩組患者3年生存率、復發率、遠處轉移率。

2 結 果

2.1 Annexin Ⅱ蛋白在NSCLC組織及癌旁組織中的表達 NSCLC組織Annexin Ⅱ陽性表達率高于癌旁正常組織(P=0.000)，肺癌組織中Annexin Ⅱ蛋白主要位于細胞膜和細胞質，而癌旁正常組織僅在細胞質中有低表達，見表1、圖1。

表1 Annexin Ⅱ蛋白在NSCLC組織及癌旁正常組織中的表達(n)

A：癌旁正常組織，B：NSCLC組織

圖1 Annexin Ⅱ蛋白在NSCLC組織和癌旁正常組織中的表達

2.2 HPA mRNA在NSCLC組織及癌旁正常組織中的表達 NSCLC組織HPA mRNA(63.18±4.39)ng/mL的表達量顯著高于癌旁正常組織(40.12±3.72)ng/mL，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3 HPA和Annexin Ⅱ的高表達與NSCLC患者臨床病理特征的關系 HPA和Annexin Ⅱ的高表達與腫瘤病理類型、腫瘤分期和淋巴結轉移均有關(均P<0.05)，與患者年齡、性別無關(均P>0.05)，見表2。

表2 HPA和Annexin Ⅱ的高表達與NSCLC患者臨床病理特征關系(n)

續表2 HPA和Annexin Ⅱ的高表達與NSCLC患者臨床病理特征關系(n)

2.4 隨訪 全部患者隨訪1～36個月，中位隨訪時間18.9個月；有效隨訪91例，失訪率9.0%(9/100)，局部復發率13.0%(13/100)，遠處轉移率21.0%(21/100)，3年生存率為57.6%，Annexin Ⅱ陽性表達患者3年生存率為35.1%，陰性表達患者3年生存率為58.7%，Annexin Ⅱ陰性表達者3年生存率顯著高于陽性表達者(P=0.001)，見圖2。HPA高表達的患者3年生存率(25.1%)明顯低于低表達(45.7%)的患者(P=0.000)，見圖3。

1：Annexin Ⅱ陰性表達組；2：Annexin Ⅱ陽性表達組

圖2 不同Annexin Ⅱ表達肺癌患者生存曲線

1：HPA低表達組；2：HPA高表達組

圖3 不同HPA表達量肺癌患者生存曲線

3 討 論

目前對肺癌預后評價依然缺乏有效的生物指標，臨床上更多依賴于影像學觀察，而一旦確診復發，會使治療難度進一步加大。

Annexin Ⅱ是膜聯蛋白家族新發現的成員，大量研究均證實Annexin Ⅱ與多種惡性腫瘤發生發展及侵襲轉移等生物學行為密切相關[6，8]。de Graauw等[7]報道稱Annexin Ⅱ在肺癌中高表達，且與分化程度呈負相關。本研究中，肺癌組織Annexin Ⅱ陽性表達率顯著高于癌旁正常組織，說明肺癌組織中Annexin Ⅱ高表達，這亦為Annexin Ⅱ作為預后評價指標提供了基礎。岳紅梅等[9]報道稱Annexin Ⅱ介導纖維蛋白酶的轉化，進一步激活基質金屬蛋白激酶，并使細胞外基質發生降解，使組織屏障發生破壞，腫瘤侵襲性增加。這也從另一方面證實Annexin Ⅱ與肺癌細胞復發、轉移有關。為了進一步驗證Annexin Ⅱ對NSCLC預后的影響，本研究對Annexin Ⅱ表達陽性和陰性患者3年生存率進行比較，結果顯示Annexin Ⅱ表達陽性患者3年生存率為35.1%，表達陰性患者3年生存率為58.7%，Annexin Ⅱ表達陰性者3年生存率顯著高于表達陽性者。說明Annexin Ⅱ表達與患者預后密切相關，術后切片分析Annexin Ⅱ表達情況，能夠為評價患者遠期預后提供一定幫助。

正常情況下，HPA表達主要限于胎盤、免疫器官和免疫細胞、平滑肌細胞及血管內皮細胞中，在其他組織及器官中低表達或者不表達，但在炎癥、損傷或者惡性腫瘤生長和轉移等多種病理改變中HPA會出現明顯的高表達[10]。既往研究已經發現HPA在乳腺癌[11]、食管癌[12]、宮頸癌[13]中存在明顯的高表達。本實驗通過ELISA方法檢測中早期NSCLC組織及癌旁正常組織中HPA mRNA的表達情況，結果表明，在肺癌組織中HPA的表達量明顯高于癌旁正常組織，說明HPA的高表達可能與肺癌的發生有關。本研究還進一步分析了HPA相對表達量與NSCLC的復發及3年生存率之間的關系，發現HPA的表達量與腫瘤患者的術后復發及生存期密切相關，HPA表達量越高，患者術后復發的概率越大，3年生存率越低，這可能與HPA參與腫瘤的侵襲轉移有關。

綜上所述，Annexin Ⅱ及HPA可以作為NSCLC預后評價的有效指標。

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王彥剛(1966-)，副主任醫師，本科，主要從事胸外科相關研究。

△通信作者，E-mail:Cerebrm99@163.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.23.040

R734.2

B

1671-8348(2017)23-3288-04

2017-04-18

2017-05-16)

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