黏附分子CD44v6、ICAM-1與早期宮頸鱗癌淋巴結轉移的關系*

劉 暉，周赟峰，曾四元，梁美蓉

(1.江西省婦幼保健院婦科腫瘤科，南昌 330006;2.南昌市第三醫院急重癥科 330009)

論著·臨床研究

黏附分子CD44v6、ICAM-1與早期宮頸鱗癌淋巴結轉移的關系*

劉 暉1，周赟峰2△，曾四元1，梁美蓉1

(1.江西省婦幼保健院婦科腫瘤科，南昌 330006;2.南昌市第三醫院急重癥科 330009)

目的 探討黏附分子CD44v6、細胞黏附分子-1(ICAM-1)與早期宮頸鱗癌淋巴結轉移的關系。方法 收集江西省婦幼保健院宮頸癌Ⅰb1期患者宮頸標本74份，正常宮頸標本20份，宮頸鱗狀細胞原位癌標本20份，采用real-time PCR法及免疫組織化學法測定宮頸組織標本CD44v6和ICAM-1的表達，免疫組織化學法測定D2-40標記的淋巴管密度(LVD)，并探討三者與宮頸癌組織分化程度及淋巴結轉移的關系。結果 CD44v6及ICAM-1在正常宮頸、宮頸鱗狀細胞原位癌、宮頸癌組織中的陽性表達率逐漸提高，分別為0、75.00%、87.84%及10.00%、45.00%、81.08%；mRNA表達水平也逐漸提高，分別為0、0.24±0.02、1.02±0.11及0.10±0.00、0.19±0.02、1.03±0.10，差異均有統計學意義(P<0.01)。正常宮頸、宮頸鱗狀細胞原位癌、宮頸癌組織中LVD逐漸提高(P<0.01)。低分化宮頸癌組織中CD44v6、ICAM-1陽性表達率及LVD高于高、中分化(P<0.01)，有淋巴結轉移宮頸癌組織中CD44v6、ICAM-1陽性表達率及LVD高于無淋巴結轉移(P<0.01)。宮頸癌組織中CD44v6、ICAM-1及LVD呈兩兩正相關。結論 CD44v6在宮頸癌進展中起促進作用，與ICAM-1及LVD協同促進宮頸癌發展，可作為判斷宮頸癌淋巴結轉移及診斷的有效指標。

宮頸腫瘤；淋巴結轉移；CD44v6；細胞間黏附分子-1；淋巴管密度

宮頸癌是常見女性惡性腫瘤，居第2位，其發病率逐年上升，且發病呈年輕化趨勢。研究發現早期宮頸癌患者即出現淋巴結轉移，晚期患者治療效果差，大部分腫瘤患者死于轉移和復發[1]。淋巴結轉移是腫瘤轉移的主要途徑，是影響宮頸癌患者預后的獨立因素[2-3]。有研究也顯示，新生淋巴管密度和淋巴管標記D2-40的表達強度與宮頸鱗癌淋巴轉移密切相關[4-5]。而細胞黏附因子(CAMs)所介導的淋巴細胞歸巢，對腫瘤淋巴轉移起到主要的影響作用[6-7]。CAMs包括鈣黏附素家族、整合素家族、選擇素家族、免疫球蛋白超家族和透明質酸黏素等5類。其中CD44v6是一種透明質酸受體，能介導透明質酸與其他基質蛋白的黏附，參與腫瘤細胞的偽足形成及遷移，使腫瘤細胞更易進入淋巴系統[8]。細胞黏附分子-1(ICAM-1)是免疫球蛋白超家族的一種，介導腫瘤細胞與淋巴細胞的黏附，促使癌細胞的擴散轉移[9]。已報道CD44v6及ICAM-1與多種腫瘤的淋巴結轉移密切相關，是腫瘤患者預后的重要影響因素[8-9]。因此探討CD44v6與ICAM-1在宮頸鱗癌細胞中的表達及其與淋巴結轉移的關系，對于闡述宮頸鱗癌的發病機制及診斷治療具有重要理論意義。

A：CD44v6陽性表達(×400)；B：ICAM-1陽性表達(×400)；C：D2-40染色陽性淋巴管(×200)

圖1 CD44v6及ICAM-1陽性表達與D2-40染色陽性淋巴管

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2013年9月至2014年9月江西省婦幼保健院婦科腫瘤科行宮頸癌根治術患者74例，根據2009年FIGO診斷標準全部為Ⅰb1期，宮頸病理均為鱗癌。所有患者術前均未進行放療或化療，臨床及病理資料完整。其中淋巴結轉移32例，無淋巴結轉移42例；高、中分化49例，低分化25例，年齡29～69歲，中位年齡47.8歲。另取20例正常宮頸組織、宮頸鱗狀細胞原位癌20例為對照。所有對象均簽署知情同意書，研究經江西省婦幼保健院倫理委員會審核通過。

1.2 方法

1.2.1 real-time PCR法檢測CD44v6及ICAM-1 mRNA表達 采用Trizol法抽提細胞總RNA，并于微量分光光度計上檢測RNA純度。通過一步法將RNA逆轉錄為cDNA，并定量PCR檢測。反轉錄體系為：總RNA模板2 μL(1 μg)，dNTP混合物2 μL，MgCl22 μL，加N-乙基-2,3-二氧代哌嗪基甲酰氯(EDPC)補充蒸餾水至25 μL。反應參數：95 ℃預變性4 min， 95 ℃變性40 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環40次。以-△△CT 值法計算靶基因的相對表達水平(目的基因相對表達水平=2-△△CT)，其中△△CT=△CT(樣本平均)-△CT(對照組)，△CT =CT(目的基因)-CT(內參基因)。引物由上海生工生物工程有限公司合成。CD44v6上游引物：5′-ATC CAG GCA ACT CCT AGT AG-3′，下游引物：5′-TGT CCC TGT TGT CGA ATG GG-3′。ICAM-1上游引物：5′-CAG ACA TCT GTG TCC CCC TC-3′，下游引物：5′-GGT CCC CTG CGT GTC C-3′。GAPDH上游引物：5′-AGC CAC ATC GCT CAG ACA-3′，下游引物：5′- TGG ACT CCA CGA CGT ACT-3′。

1.2.2 免疫組織化學染色法(SP)測定CD44v6、ICAM-1及D2-40的表達 部分標本石蠟包埋，3～5 μm連續切片，二甲苯脫蠟，70%、75%、80%、85%、95%梯度乙醇脫水，3%過氧化氫孵育10 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，抗原修復，PBS洗滌，山羊抗血清封閉1 h，一抗4 ℃過夜孵育，PBS洗滌，二抗室溫孵育，PBS洗滌，3,3二氨基聯苯胺(DAB)顯色，自來水沖洗、復染、脫水、透明、封片。以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.2.3 CD44v6及ICAM-1陽性表達結果判斷 CD44v6蛋白陽性表達主要定位于細胞膜上，呈棕黃色或棕褐色，ICAM-1蛋白陽性表達主要定位于細胞膜或者細胞質上，呈棕黃色或棕褐色。每張切片在高倍鏡下選擇10個視野，HIPAS100圖像分析軟件對圖形進行分析，染色細胞小于10%為陰性(-)，染色細胞大于或等于10%為陽性(+)。

1.2.4 D2-40標記的淋巴管密度(LVD) D2-40標記的陽性細胞呈棕黃色，主要定位于淋巴內皮細胞，其標記的淋巴管多為閉塞狀態，呈條狀或孤立狀。參考Weidner等報道對LVD進行統計，在400倍鏡下選取5個視野對LVD進行統計，LVD在宮頸癌組織中定義為腫瘤中心組織實質內LVD，在正常宮頸組織中定義為基底膜下2 mm以內間質內的LVD[5]。

2 結 果

2.1 CD44v6及ICAM-1陽性表達 CD44v6在正常宮頸、宮頸鱗狀細胞原位癌、宮頸癌組織中的陽性表達率分別為0、75.00%、87.84%，差異有統計學意義(P<0.01)。ICAM-1在正常宮頸、宮頸鱗狀細胞原位癌、宮頸癌組織中的陽性表達率分別為10.00%、45.00%、81.08%，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖1。

2.2 CD44v6及ICAM-1 mRNA表達 正常宮頸、宮頸鱗狀細胞原位癌、宮頸癌組織中CD44v6 mRNA表達水平分別為0、0.24±0.02、1.02±0.11，差異有統計學意義(P<0.01)。在正常宮頸、宮頸鱗狀細胞原位癌、宮頸癌組織中ICAM-1 mRNA表達水平分別為0.10±0.00、0.19±0.02、1.03±0.10，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖2。

A：正常宮頸；B：鱗狀細胞原位癌；C：宮頸癌

圖2 CD44v6及ICAM-1 mRNA表達

2.3 CD44v6及ICAM-1與宮頸癌的臨床病理參數的關系 CD44v6在高、中分化宮頸癌組織中的陽性表達率低于低分化組織，在有淋巴結轉移宮頸癌組織中陽性表達率高于無淋巴結轉移，差異均有統計學意義(P<0.01)。ICAM-1在高、中分化宮頸癌組織中的陽性表達率低于低分化組織，在有淋巴結轉移宮頸癌組織中陽性表達率高于無淋巴結轉移，差異均有統計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 CD44v6及ICAM-1與宮頸癌的臨床病理參數的關系[n(%)]

a：P<0.01，與高、中分化比較；b:P<0.01，與有淋巴結轉移比較

2.4 宮頸組織D2-40標記的LVD計數及與病理參數的關系 D2-40標記的陽性細胞呈棕黃色，主要定位于淋巴管內皮細胞，其標記的淋巴管多為閉塞狀態，呈條狀或孤立狀的。其中宮頸癌組織LVD明顯高于正常宮頸、鱗狀細胞原位癌。LVD在高、中分化宮頸癌組織中低于低分化組織，在有淋巴結轉移宮頸癌組織中高于無淋巴結轉移，差異均有統計學意義(P<0.01)。見表2。

表2 宮頸組織D2-40標記的LVD計數及與病理參數的關系

a：P<0.01，與正常宮頸比較；b:P<0.01，與原位癌比較；c:P<0.01，與高、中分化比較；d:P<0.01，與有淋巴結轉移比較

2.5 CD44v6、ICAM-1與LVD相關性分析 經Pearson相關性分析，宮頸癌組織中CD44v6和ICAM-1表達呈正相關(r=0.546，P<0.01)，宮頸癌組織中CD44v6和LVD呈正相關(r=0.472，P<0.01)，宮頸癌組織中ICAM-1和LVD呈正相關(r=0.736，P<0.01)。

3 討 論

侵襲和轉移是宮頸癌等惡性腫瘤的主要特征，是患者術后復發甚至死亡的主要原因[10]。淋巴結轉移是患者常見的轉移方式，在很大程度上影響著患者的預后[2-3]。LVD是評價淋巴管生成最主要的指標，且LVD與腫瘤淋巴結轉移密切相關已得到不同研究人員的驗證[4-5]。目前國內外研究公認的標記物有D2-40抗體，該抗體是一種氧連接型的唾液酸糖蛋白，能特異性地結合腫瘤淋巴管內皮表面的抗原決定簇，已用此標記物來標記胃癌、乳腺癌和肺癌等的淋巴管[5,11]。本研究表明，D2-40標記的LVD在正常宮頸、宮頸鱗狀細胞原位癌、宮頸癌組織中逐漸增大，且低分化腫瘤中LVD高于高、中分化，有淋巴結轉移LVD高于無淋巴結轉移，與Xiong等[5]研究結果一致，其研究表明宮頸鱗癌及癌旁組織LVD高于正常宮頸組織，且與淋巴管轉移及侵犯密切相關。進而提示LVD與宮頸癌的發生、發展及轉移密切相關，并起促進作用。

淋巴細胞歸巢是導致淋巴轉移的主要原因，其過程涉及成熟淋巴細胞向外周淋巴器官歸巢，再循環，并遷移到炎癥部位，其中CAMs起主要介導作用。CAMs是存在于細胞表面的糖蛋白，能夠介導細胞-細胞，細胞-基質之間的相互作用。CAMs分為五大類，包括鈣黏附素家族、整合素家族、選擇素家族、免疫球蛋白超家族和透明質酸黏素。其中CD44為與淋巴細胞歸巢最密切相關的黏附分子，是一種跨膜透明質酸受體，其基因定位于11號染色體上。研究表明，CD44v6與多種腫瘤的進展、轉移及預后密切相關。如孫麗萍[12]、蔡旺等[13]研究表明，CD44v6在正常宮頸組織、宮頸上皮內瘤變組織及宮頸癌組織中的陽性表達率逐漸升高，且與病理分級，淋巴結轉移密切相關。Kainz等[14]研究表明CD44v6表達陽性宮頸癌患者更容易發生淋巴結轉移，且預后差。本研究表明，CD44v6在正常宮頸、宮頸鱗狀細胞原位癌、宮頸癌組織中表達水平逐漸升高，且低分化腫瘤中CD44v6陽性表達率高于高、中分化，有淋巴結轉移高于無淋巴結轉移，與文獻[12-14]報道一致。說明CD44v6在宮頸癌的發生、發展及轉移中起著促進作用。同時本研究還發現，CD44v6的表達與LVD呈正相關，與陳文靜等[11]在乳腺癌中的研究一致，可能是宮頸癌組織中CD44v6的過表達能促使癌細胞與間質間的黏附加深，促使瘤細胞分泌更多淋巴管生成因子，從而誘導淋巴管的產生，導致LVD增加。

另外ICAM-1作為CAMs的一種，能與淋巴細胞功能相關蛋白結合，從而參與機體免疫、炎癥及腫瘤的發生、轉移等過程。本研究表明，ICAM-1在正常宮頸、宮頸鱗狀細胞原位癌及宮頸癌組織中表達水平逐漸升高，與ICAM-1在大多數腫瘤中表達趨勢一致[15]，且低分化腫瘤中CD44v6陽性表達率高于高、中分化，有淋巴結轉移高于無淋巴結轉移，與陳江平等[15]的研究一致，說明ICAM-1在宮頸癌發生、發展及轉移中起促進作用。同時本研究還發現宮頸癌中ICAM-1的表達與LVD呈正相關，與曹景愷等[16]在結腸癌中的研究結果一致，進一步說明ICAM-1的過表達使得宮頸癌細胞易發生淋巴結轉移。

本研究還發現，宮頸癌組織中CD44v6與ICAM-1表達呈正相關，與邵建富等[17]在胃癌研究中的報道一致。同時Olaku等[18]研究發現在CD44v6敲除小鼠中，通過給予ICAM-1特異性抗體，能抵消CD44v6所產生的變化。提示二者在宮頸癌中可能起協同作用，在癌細胞的黏附過程中有重疊效應，從而對宮頸癌的發生、發展及轉移起促進作用。

綜上所述，宮頸鱗癌組織中ICAM-1及CD44v6陽性表達率隨著腫瘤惡性程度的加深逐漸提高，并與腫瘤分化程度及淋巴結轉移密切相關，同時與LVD呈正相關，二者在宮頸癌的發生、發展及淋巴結轉移中起協同作用，聯合檢測可能作為早期宮頸癌診斷及預后的判斷標準。

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Relationship between CD44v6,ICAM-1 and lymph node metastasis in early stage of cervical squamous cell carcinoma*

LiuHui1,ZhouYunfeng2△,ZengSiyuan1,LiangMeirong1

(1.DepartmentofGynecologicalOncology,JiangxiProvincialMaternalandChildHealthCareHospital,Nanchang,Jiangxi330006,China;2.ICU,NanchangMunicipalThirdHospital,Nanchang,Jiangxi330009,China)

Objective To investigate the relationship between adhesion molecule CD44v6,intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) and lymph node metastasis in early stage of cervical squamous cell carcinoma.Methods Seventy-four specimens of cervical cancer stageⅠb1,20 specimens of normal cervical tissue and 20 specimens of cervical squamous cell in situ carcinoma were collected from Jiangxi Provincial Maternal and Child Health Care Hospital.The expression of CD44v6 and ICAM-1 in cervical tissue was detected by real-time PCR and immunohistochemistry.The lymphatic vessel density (LVD) labeled by D2-40 was detected by immunohistochemistry.The relationship of CD44v6,ICAM-1 and LVD with the differentiation degree and lymph mode metastasis was investigated.Results The positive expression rate of CD44v6 and ICAM-1 in normal cervix,cervical squamous cell carcinoma in situ,and cervical carcinoma tissues was gradually increased,which were 0,75.00%,87.84% and 10.00%,45.00%,81.08% respectively.Their mRNA expression amount was gradually increased,which were 0,0.24±0.02,1.02±0.11 and 0.10±0.00,0.19±0.02,1.03±0.10 respectively,the differences were statistically significant (P<0.01).LVD was gradually increased in normal cervix,cervical squamous cell carcinoma in situ,and cervical carcinoma (P<0.01).The expression of CD44v6,ICAM-1 and LVD in low differentiated cervical carcinoma tissue was higher than that in high and middle differentiated cervical carcinoma (P<0.01).The expression of CD44v6,ICAM-1and LVD in lymph node metastasis was higher than that in non-lymph node metastasis (P<0.01).The expression of CD44v6,ICAM-1 and LVD in cervical cancer tissue had each two positive correlation (P<0.01).Conclusion CD44v6 plays a promoting role in the progression of cervical cancer,which with ICAM-1 and LVD synergically promote the cervical cancer development,and could be used as an effective indicator for judging lymph node metastasis and diagnosis of cervical cancer.

uterine cervical neoplasms;lymph node metastasis;CD44v6;intercellular adhesion molecule-1;lymphatic vessel density

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.22.013

江西省衛生計生委科技計劃(20155545)。 作者簡介：劉暉(1979-)，主治醫師，碩士，主要從事婦科腫瘤基礎及臨床診治的研究。△

，E-mail:1345261860@qq.com。

R737.33

A

1671-8348(2017)22-3066-04

2017-02-24

2017-04-12)