YWHAE表達沉默對胃癌MGC803細胞增殖的影響

黃幼生，解娜，張藝馨，孫芳嬌，羅志飛，薛逢貴

(海南醫學院第一附屬醫院病理科，海南海口571101)

YWHAE表達沉默對胃癌MGC803細胞增殖的影響

黃幼生，解娜，張藝馨，孫芳嬌，羅志飛，薛逢貴

(海南醫學院第一附屬醫院病理科，海南海口571101)

目的探討沉默YWHAE表達對胃癌細胞增殖的影響。方法實驗分為三組，未轉染組，構建YWHAE短發夾RNA(shRNA)表達載體及相應空載載體，慢病毒包裝后分別感染胃癌MGC803細胞(干擾組，對照組)，應用Western blot、RT-PCR方法檢測YWHAE沉默效率；MTT技術觀察YWHAE表達沉默前后細胞增殖變化；流式細胞術、細胞克隆實驗檢測細胞周期、凋亡及克隆形成變化情況。結果慢病毒包裝YWHAE-shRNA后成功感染胃癌MGC803細胞；RT-PCR、Western blot檢測結果顯示，與對照組比較，干擾組MGC803細胞YWHAE基因表達明顯降低，抑制效率為72.7%。MTT結果顯示，干擾組細胞增長速率明顯低于對照組細胞，72 h增長倍數分別為1.56、2.43，差異有顯著統計學意義(P＜0.01)；細胞克隆實驗結果顯示，干擾組及對照組克隆形成率分別為6.24%、31.00%，差異有顯著統計學意義(P＜0.01)。流式細胞術檢測顯示，YWHAE基因表達沉默后，MGC803細胞凋亡率增加，由未消減前的3.23%增加到9.83%，差異有顯著統計學意義(P＜0.01)；相比對照組細胞在G1期的比例(57.88%)，干擾組G1期細胞比例明顯增加(72.42%)，差異有顯著統計學意義(P＜0.01)。結論沉默YWHAE表達能抑制胃癌MGC803細胞增殖，可能與誘導細胞周期阻滯，促進細胞凋亡有關。

YWHAE；胃癌；RNA干擾；細胞增殖；凋亡

胃癌是我國發病率及死亡率位居第二的惡性腫瘤，多數死于胃癌的轉移、復發[1-2]。精準醫療概念的提出為晚期胃癌患者的治療提供了方向。例如，曲妥珠單抗赫賽汀靶向治療HER2擴增的胃癌患者能夠提高患者3個月的生存期[3]。然而，特異性分子靶點研究有限，靶向藥物開發較少，效果不理想。因而，探討胃癌分子機制、尋找藥物分子靶標對設計靶點藥物及提高胃癌治療水平具有重要意義。

14-3-3蛋白家族是一個由7個亞型(β、ε、η、γ、τ、ζ和σ)組成、普遍存在又高度保守的酸性蛋白家族，是在哺乳動物細胞中含量最豐富的蛋白之一[4-5]。YWHAE (tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygen-ase activation protein，epsilon polypeptide)基因編碼的14-3-3ε蛋白是其家族中重要的成員之一[4]。目前研究發現在肝癌[6]、結腸癌[7]、胃癌[8]、腎癌[9]等惡性腫瘤中14-3-3ε存在高表達，高表達的14-3-3ε可以促進癌細胞增殖、遷移和抑制凋亡，其機制可能是14-3-3ε與CDC25、c-myc、RKIP等蛋白相互作用[8,10-11]，促進細胞周期轉換、抑制細胞凋亡等相關。YWHAE與胃癌的關系研究較少，且其在胃癌中的作用還存在爭議，有學者認為，YWHAE在胃癌組織中高表達，是一個促癌基因[8]；也有學者認為高表達的YWHAE具有抑制胃癌細胞生長的作用，是一個抑癌基因[12]。

為進一步探討、甄別YWHAE與胃癌的關系，筆者應用RNA干擾技術沉默胃癌MGC803細胞YWHAE基因表達，觀察YWHAE沉默前后癌細胞功能學變化，為闡明YWHAE基因與胃癌發生發展的分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料胃癌MGC803細胞系購自中國生物典型保藏中心；RPMI1640培養基，PVDF膜、聚丙烯酰胺為博士得產品；Gibco?胎牛血清購Thermofisher公司。YWHAE shRNA設計、GV248載體連接及慢病毒包裝由上海吉凱生物技術有限公司完成，靶向的YWHAE基因序列為CTGAGTGAAGAAAGCTATA；YWHAE單克隆抗體、山羊抗鼠二抗均購自abcam公司，GAPDH單抗為博士得產品。Trizol試劑盒、RT-PCR相關試劑盒(FastQuant RT Kit(With gDNase)，2×Taq Plus PCR MasterMix)為北京天根生物有限公司產品。蛋白裂解液、蛋白marker及BCA蛋白定量試劑盒為杭州碧云天產品。

1.2 方法

1.2.1 人胃癌細胞培養及轉染胃癌MGC803細胞孵育在含10%小牛血清的RPMI1640培養基中，培養于37℃、5%CO2飽和濕度培養箱內。將處于對數生長期的MGC803細胞接種于6孔板，每孔接種5×104個細胞。在細胞融合度30%時進行轉染，具體轉染步驟按吉凱基因提供的說明書進行。簡而言之，實驗分為三組：未轉染組、對照組、shRNA-YWHAE干擾組(干擾組)。去除舊培養基，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2遍，將慢病毒包裝的shRNA-YWHAE及其對照病毒與無血清及抗生素的培養基混合后分別加入6孔板各孔內孵育胃癌細胞。轉染48 h后觀察轉染效率，待細胞融合度達80%時收取細胞進行下一步干擾抑制效率及功能試驗檢測。

1.2.2 RT-PCR檢測提取各組細胞總RNA，提取方法參照Trizol試劑盒說明書進行操作；Primer 6.0引物設計軟件設計YWHAE、GAPDH mRNA引物，mRNA序列從NCBI網站中獲取，按軟件評分選取最佳引物引物由上海生工公司合成。YWHAE上游引物：5'-TGCGGAGAACAGCCTAGTG-3'，下游引物：5'-CCTAAGCGAATAGGATGCGTT-3'；GAPDH(內參)上游引物：5'-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3'，下游引物：5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3'。逆轉錄及PCR反應按FastQuant RT Kit(With gDNase)，2×Taq Plus PCR MasterMix試劑盒說明書進行。PCR反應條件為：預反應95℃2 min，變性30 s，60℃30 s，72℃延伸45 s，25個循環，循環終止后72℃延伸5min。將反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳、拍照、Tanon 5 000凝膠成像分析軟件灰度掃描。

1.2.3 Western blot檢測收集各組細胞，RIPA裂解細胞、溶解蛋白，BCA法定量。每個樣品上樣30 μg，12%聚丙烯酰胺膠電泳分離。4℃下轉移固定蛋白于PVDF膜上，5%脫脂奶粉25℃下封閉2 h，轉移膜至一抗孵育盒內，YWHAE(1:500)、GAPDH(內參)一抗(1:1 000)4℃孵育過夜。次日，TBST洗滌3遍，加入二抗(1:4 000)25℃下孵育1.5 h，TBST洗滌3遍，增強型ECL底物顯色，Tanon 5200化學發光成像系統成像并分析其光密度。

1.2.4 MTT檢測將各組細胞消化、吹打，調整細胞懸液濃度2×103/mL，每孔100 μL接種于96孔板，置37℃，5%CO2恒溫箱中孵育，待貼壁0 h、24 h、48 h、72 h、96 h后每孔加入200 μL MTT溶液(5 mg/mL)，繼續培養4 h，離心，小心吸掉上清液，每孔加入100 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩15 min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD570處測量各孔的吸光值。以時間為橫坐標，D值為縱坐標，繪制生長曲線。

1.2.5 細胞克隆實驗將各組細胞消化、吹打、奇數，按每組800個細胞種植于6孔板中，每組三復孔，繼續置37℃，5%CO2恒溫培養箱中孵育，每隔3 d換新鮮培養液一次，15 d后或控制組大多數克隆細胞數大于50時終止培養，PBS洗滌2次、多聚甲醛固定、GIEMSA染色、拍照、計克隆數。

1.2.6 細胞周期及凋亡檢測將各組癌細胞消化、吹打、PBS重懸，清洗2遍，去上清，預備細胞周期檢測的細胞重懸于70%酒精中，4℃過夜，PI染色；預備細胞凋亡檢測的細胞1×binding buffer洗滌細胞沉淀一次，1×staining buffer重懸細胞沉淀，采用Annexin V-APC染色；FACSCalibur流式細胞儀檢測細胞周期及凋亡。

1.3 統計學方法應用SPSS18.0軟件進行統計學分析，計量資料以均數±標準差()表示，組內比較均采用配對Student's t檢驗，計數資料比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 YWHAE干擾效率檢測本研究針對YWHAE基因設計了2對shRNA，連接GV248慢病毒質粒，慢病毒包裝后感染胃癌細胞MGC803。轉染48 h后觀察轉染效率，發現95%以上癌細胞出現熒光，表明感染效率在95%以上，滿足進一步實驗要求(圖1)。隨即，應用RT-PCR、Western blot驗證YWHAE在基因及蛋白水平上的敲除效率。結果顯示，相比對照組，干擾組1#、2#mRNA及蛋白表達率分別下降72.7%、53.6%及71.5%、55.2%(圖2)，表明2對YWHAE-shRNA均明顯抑制YWHAE基因的表達，差異有顯著統計學意義(P＜0.01)。據此，本研究選擇干擾組1#進行下一步實驗。

圖1 慢病毒轉染48 h后白光及熒光圖(×200)

圖2 慢病毒介導YWHAE-shRNA轉染胃癌細胞MGC803沉默效率檢測

2.2 YWHAE表達沉默對胃癌MGC803細胞生長的影響為進一步觀察YWHAE表達沉默對胃癌細胞MGC803生長的影響，MTT檢測被應用去觀察轉染YWHAE-shRNA前后MGC803細胞生長速度的變化。結果顯示，干擾組細胞的生長速度明顯低于對照組及未轉染組，呈現時間依賴性抑制，24 h、48 h、72 h抑制效率分別為18.9%，27.3%，44.5%(圖3)，干擾組細胞增長速率明顯低于對照組細胞，72 h增長倍數分別為1.56、2.43，差異有顯著統計學意義(P＜0.01)，未轉染組及對照組差異無統計學意義(P＞0.05)，表明YWHAE表達沉默能抑制胃癌細胞MGC803的生長。

2.3 YWHAE表達沉默對胃癌細胞克隆形成的影響克隆性生長是癌細胞生長的一大特點，為探討YWHAE表達沉默是否干擾腫瘤細胞的克隆形成，細胞克隆形成實驗被應用。結果顯示，抑制YWHAE基因表達后，癌細胞克隆形成率明顯降低，干擾組、對照組及未轉染組克隆形成率分別是6.24%、31.00%、31.95%，干擾組是對照組及未轉染組克隆形成率的20.13%及19.53%，差異有顯著統計學意義(P＜0.01)，兩個控制組間比較差異無統計學意義(P＞0.05)，表明沉默YWHAE的表達能顯著降低癌細胞腫瘤克隆形成率(圖4)。

圖3 YWHAE表達沉默對胃癌細胞MGC803細胞生長的影響(MTT檢測法)

2.4 YWHAE表達沉默對胃癌細胞凋亡及細胞周期的影響為分析YWHAE表達沉默抑制胃癌細胞MGC803生長的原因，流式細胞術被應用去檢測YWHAE基因表達沉默前后細胞凋亡及細胞周期變化。分析顯示，YWHAE表達沉默后，細胞凋亡率明顯增加，干擾組細胞在轉染后3 d平均細胞凋亡率為9.83%，而對照組及未轉染組細胞平均凋亡率分別為3.23%、2.90%，差異有顯著統計學意義(P＜0.01)，對照組與未轉染組間差異無統計學意義(P＞0.05)，見圖5。

YWHAE表達沉默后，干擾組細胞處于細胞周期G1期者為72.4%，而對照組及未轉染組細胞分別為57.9%及56.4%，差異有顯著統計學意義(P＜0.01)，對照組與未轉染組間差異無統計學意義(P＞0.05)，表明YWHAE在胃癌MGC803細胞中表達沉默能捕獲細胞周期在G1期(圖6、表1)。

圖4 細胞克隆形成圖

圖5 轉染YWHAE-shRNA后，各組細胞凋亡數量統計流式圖

圖6 轉染YWHAE-shRNA后，各組細胞周期分布流式圖

表1 轉染YWHAE-shRNA后各組細胞周期變化比較()

表1 轉染YWHAE-shRNA后各組細胞周期變化比較()

3 討論

14-3-3家族基因定位于染色體17p13.3，其編碼蛋白由蘇氨酸及絲氨酸結合蛋白組成的7個亞基構成，在真核生物中普遍存在表達[4-5]。14-3-3蛋白具有多種生物活性功能，參與細胞凋亡、生長代謝調控、細胞周期及磷酸化依賴方式蛋白質轉運過程等多種細胞生理活動[4-5]。近年來，發現多種腫瘤存在14-3-3蛋白異常表達，可能通過激活Ras-Raf及AKT/mTOR等多條信號通路參與腫瘤的發生發展[4-5，14-15]。

YWHAE是14-3-3家族中的重要成員之一，在多種惡性腫瘤組織中表達增高，包括肝癌[6，16]、胃癌[8]、腸癌[7]，腎癌[9]等。研究發現，YWHAE在正常肝組織內表達缺失或弱表達，在肝癌組織內高表達，與癌上皮間質轉化及侵襲轉移相關，過表達YWHAE的肝癌患者預后不良[6，16]。Liang等[9]和Wang等[17]發現高表達的YWAHE與腎癌、結腸癌的預后不良相關。這些研究表明YWHAE在腫瘤發生發展中可能扮演著癌基因的角色。

在胃癌組織中，Yan等[8]認為，YWHAE存在高表達，與胃癌的分期及轉移相關；抑制YWHAE表達，能降低胃癌細胞SGC7901細胞生長速度，捕獲細胞周期在G1期，認為YWHAE在胃癌中是一個促癌基因。但也有學者發現，在胃癌組織中存在YWHAE基因低表達，沉默YWHAE表達，促進了胃癌細胞的生長及轉移[12]。

筆者前期研究發現腸癌組織中，YWHAE存在過表達，與腸癌的淋巴結轉移相關[7]。為進一步驗證YWHAE基因表達與胃癌的關系，本研究應用RNA干擾技術沉默胃癌MGC803細胞YWHAE表達后，發現癌細胞生長速度呈時間依賴性降低，72 h抑制率為44.5%；克隆形成能力同樣出現顯著性降低，干擾組癌細胞克隆形成率是對照組的19.53%。表明沉默YWHAE基因表達能夠降低胃癌細胞的生長，支持了Yan等[8]的實驗結果。

目前研究發現在結直腸癌[7，17]、肝癌[6，16]、胃癌[8]和腎癌[9]等惡性腫瘤中，沉默YWHAE表達能夠誘導癌細胞凋亡及細胞周期阻滯，從而抑制癌細胞生長。其機制可能是抑制14-3-3ε表達與減少胞內線粒體、降低cyclinE、c-myc表達相關。本項目發現，YWHAE表達沉默后，胃癌細胞MGC803凋亡率增加，細胞周期捕獲在G1期，提示YWHAE可能通過促進胃癌細胞凋亡、誘導細胞G1周期阻滯的方式抑制胃癌細胞的生長。

綜上所述，沉默YWHAE的表達能抑制胃癌細胞的生長，其機制可能與癌細胞G1周期捕獲及誘導細胞凋亡相關，表明YWHAE的過表達可能與胃癌的發生有關。

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Silencing of YWHAE expression suppresses the proliferation ability of gastric cancer MGC803 cells.

HUANG You-sheng,XIE Na,ZHANG Yi-xin,SUN Fang-jiao,LUO Zhi-fei,XUE Feng-gui.Department of Pathology,the First Affiliated Hospital of Hainan Medical University,Haikou 571101,Hainan,CHINA

ObjectiveTo investigate the effect of YWHAE expression silencing on the proliferation of gastric cancer cells.MethodsThe expression vector of short hairpin RNA(shRNA)sequences for YWHAE(interference group)and the control vector(control group)were constructed,which were used to infect the gastric cancer cells MGC803 after they were produced and packaged by lentiviruses.The expression levels of YWHAE were assayed by Western blot and RT-PCR.Proliferation was evaluated by MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide)colorimetric assay.Colony formation analysis was used to determine growth properties of transduced cells. Cell cycle and apoptosis were determined by flow cytometry.ResultsLentivirus-mediated shRNA-YWHAE was successfully transfected into gastric cancer cells.Compared with the control group,the expression of YWHAE was significantly decreased by 72.7%in the interference group by Western blot,RT-PCR analysis.The results of MTT showed that the proliferation ability of the interference group cells was significantly slower than that of the control group,and the cell growth times were 1.56 and 2.43 for 72 h,respectively(P＜0.01).Cell cloning experiment results showed that the clone formation rate of the interference group was 6.24%,which was significantly lower than 31.00%of the control group(P＜0.01).Flow cytometry showed that reduced YWHAE expression in gastric cancer cells lead to the increasing of cell apoptosis rate(from 3.23%to 9.83%),and the difference was statistically significant(P＜0.01).Compared with the control group(57.88%),the proportion of the interference group cells(72.42%)in G1phase increased significantly(P＜0.01). ConclusionThe expression silencing of YWHAE inhibits the proliferation ability of gastric cancer MGC803 cells, which may be associated with cell apoptosis promotion and cell cycle G1arrest.

YWHAE;Gastric cancer;RNAinterference(RNAi);Proliferation;Apoptosis

R735.2

A

1003—6350（2017）16—2581—05

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.16.001

2017-04-01)

國家自然科學基金(編號：81260321)

黃幼生。E-mail：hys768811@yahoo.com.cn