一株解淀粉芽孢桿菌的分離鑒定及其生物學特性研究

楊冬靜, 張成玲，徐 振，趙永強，孫厚俊，謝逸萍

(江蘇徐淮地區徐州農業科學研究所/農業部 甘薯生物學與遺傳育種重點實驗室，江蘇 徐州 221131)

一株解淀粉芽孢桿菌的分離鑒定及其生物學特性研究

楊冬靜, 張成玲，徐 振，趙永強，孫厚俊，謝逸萍*

(江蘇徐淮地區徐州農業科學研究所/農業部 甘薯生物學與遺傳育種重點實驗室，江蘇 徐州 221131)

從土壤中分離篩選到一株具有廣譜抗菌活性的拮抗細菌，命名為XZ-1。采用平板對峙培養法測定其抑菌活性，結果顯示：XZ-1對大蒜葉枯病菌、草莓炭疽病菌等8種重要農作物病害的病原真菌均具有較強的拮抗活性，且抑菌帶直徑均大于10 mm。采用PCR擴增16S rDNA片段并用MEGA 6.0軟件構建系統發育進化樹，結果表明XZ-1與解淀粉芽孢桿菌16S rDNA序列KY828923聚為一簇，因此初步鑒定該菌株為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)。采用單因素試驗設計對XZ-1的生物學特性進行研究，結果表明：XZ-1在pH值為6時生長最佳，在氯化鈉濃度為0～10 g/L之間時生長情況相對較好；對光暗不敏感，致死溫度為100 ℃、10 min。

解淀粉芽孢桿菌；拮抗活性；生物學特性

化學藥劑在病害防治中起到重要作用，但生產上頻繁和高濃度地使用化學藥劑會導致農藥殘留增加和環境污染問題，嚴重威脅人類健康。隨著人們對農作物產品質量和安全性的日益重視，化學藥劑對人類的危害已成為關注焦點，對植物病害采取生物防治逐漸成為一種新的發展趨勢[1-3]。

生物防治避免了化學藥劑帶來的一系列環境問題，其最大的優點是不污染環境，這是化學防治所不能比的；其次，生防因子廣泛存在于自然界，對人畜安全，病原菌不易產生抗藥性，還有一些生防菌具有降解農藥的特性，可降低農副產品中農藥殘留量，因此，生物防治已經成為國內外植保科研工作者的研究熱點，每年有大量有關生防菌株篩選鑒定、防治效果以及生防菌作用機理等的報道[4-5]。

生防細菌繁殖速度快，通過與病原菌競爭根圍營養和根部侵染空間位點，或分泌抗菌物質抑制多種病原菌的生長和擴展，或通過觸發植物中水楊酸、茉莉酸或乙烯信號通路誘導植物產生抗病性，引起植物體內各種生理生化變化，如植物防御酶系的表達、病程相關蛋白的積累等，從而達到抵御病原菌侵染的目的[6-7]。關于生防菌株產業化的報道也較多，如德國ABiTEP GmbH 公司對解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens FZB42進行全基因組測序，并已有諸多的研究成果報道，FZB42生防促生微生物制劑已經產業化；江蘇省農業科學院植物保護研究所開發的枯草芽孢桿菌“紋曲寧”對于水稻紋枯病菌和稻曲病菌具有較好的防治效果[8-11]。目前，江蘇徐淮地區關于生防菌株篩選以及主要農作物病害生物防治的研究報道罕見。本課題組采集土壤樣本，分離、篩選優良拮抗細菌，研究了其對引起主要農作物病害的病原菌的拮抗作用，以期為農作物病害提供新的生防菌株，并為生防菌劑的開發應用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試真菌 供試病原真菌中甘薯干腐病菌和大蒜葉枯病菌由本課題組分離和保存；草莓炭疽病菌、絲瓜炭疽病菌、小麥全蝕病菌、大豆菌核病菌、甜瓜枯萎病菌以及小麥紋枯病菌由南京農業大學殺菌劑課題組饋贈。

1.1.2 細菌和真菌培養基 生防菌菌株分離篩選及培養采用LB培養基(胰蛋白胨10.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，氯化鈉10.0 g/L)，對病原菌的拮抗活性測定使用PDA培養基(土豆20 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂粉15 g/L)。

1.2 拮抗菌分離

2016年10月從江蘇徐州市銅山區班井村甘薯種植地、周圍蔬菜地以及果園地果樹根際土壤采集土樣共36份。每份土樣稱取10 g，分別放入裝有90 mL無菌水和玻璃珠的三角瓶中，采用搖床振蕩15～30 min，待土樣充分混勻后，用移液槍分別吸取1 mL土樣懸浮液，加入盛有9 mL無菌水的試管后充分混勻，即為10-2倍土樣稀釋液；采用同樣的方法，依次制備10-3、10-4、10-5、10-6倍土樣稀釋液。將制備好的各梯度倍數的土樣稀釋液分別取100 μL均勻涂布在LBA平板中，封上Parafilm封口膜，平板倒置于37 ℃生化培養箱中培養24 h以上。觀察生長出的細菌菌落的顏色、形態、透明度等特征，并挑取平板中不同特征的菌落重新純化，將獲得的純培養移入LBA斜面，置于4 ℃冰箱中保存，備用。

1.3 拮抗活性測定

將篩選到的菌株接種到LB液體培養基中，于28 ℃、180 r/min搖床中振蕩培養24 h后獲得發酵液備用。采用平板對峙法[12]測定生防細菌的拮抗活性，詳細操作步驟不再贅述，待對照中兩病原菌菌絲交接時，記錄抑菌帶直徑，每處理3個重復。

1.4 16S rDNA序列片段擴增及分析

采用基因組DNA抽提試劑盒(上海生工生物有限公司)提取XZ-1基因組DNA。細菌16S rDNA 片段擴增通用引物序列如下：27F(5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′)和1492R (5′-TACGGYTACCTTGTTACGACT T-3′)[13]。PCR擴增條件如下：94 ℃預變性2 min，98 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環32次；再在72 ℃條件下延伸5 min后終止反應。PCR擴增反應體系如下：基因組DNA模板1 μL，ddH2O 10 μL，KOD酶1 μL，dNTP 10 μL，KOD buffer 25 μL，27F 1.5 μL，1492R 1.5 μL。0.8%瓊脂糖凝膠電壓100 V電泳檢測后，將有特異性條帶的擴增產物交由上海生工進行測序。將所測序列與在NCBI中已知的序列進行Blast同源性比對分析，采用MEGA 6.0軟件鄰接法構建系統發育進化樹，Bootstrap值取1000，以此初步確定該拮抗菌株的系統發育學地位。

1.5 XZ-1的生物學特性研究

1.5.1 pH值對XZ-1生長的影響 用0.1 mol/L HCl 和0.1 mol/L NaOH 調節LB液體培養基的pH值，設5、6、7、8、9、10、11和12等8個梯度。用三角瓶分別取25 mL調節pH后的培養基；將活化好的XZ-1菌液50 μL接種到各培養基中，每處理均設3次重復，28 ℃、180 r/min搖培24 h后記錄OD600。

1.5.2 氯化鈉濃度對XZ-1生長的影響 以LB培養基為基礎培養基，其中NaCl稱取量分別設置成0、5、10、15、20和25 g/L等6個梯度；將活化好的XZ-1菌液50 μL分別接種到各不同氯化鈉濃度的液體培養基中，每處理均設3次重復，28 ℃、180 r/min搖培24 h后記錄OD600。

1.5.3 光照條件對XZ-1生長的影響 將活化好的XZ-1菌液50 μL接種到LB液體培養基中，分別設置光照、黑暗和12 h光照12 h黑暗光暗交替3個處理，每處理均設3次重復，28 ℃、180 r/min搖培24 h后記錄OD600。

1.5.4 XZ-1致死溫度測定 設置45、50、55、60、65、70、75、80、90和100 ℃共10個溫度梯度，無菌條件下取100 μL活化好的菌液置入1.5 mL滅菌離心管中蓋好，分別置于以上各梯度溫度的水浴鍋中水浴10 min，然后取出涂板，觀察有無菌落長出，根據菌落生長與否，確定致死溫度。

1.5.5 XZ-1生長對氧氣的需求 采用深層瓊脂法[14]，首先制備XZ-1發酵液，備用；然后取溶化的LBA培養基裝入滅菌試管中，100 ℃水浴使培養基保持不凝固的狀態；將試管取出，在室溫條件下冷卻至45～50 ℃；再吸取100 μL發酵液加入試管中，快速搓動試管使菌液均勻分布于培養基，然后將試管置于冰浴中以便于瓊脂迅速凝固。將接種好菌液的試管置于28 ℃生化培養箱內靜置培養。試驗重復3次，2 d后觀察菌體在試管中的生長部位，直到10 d后結果基本清晰為止。根據細菌在試管中的生長部位，判斷該菌株對氧氣的需求能力，將其分為以下5 種類型：耐氧厭氧菌在試管培養基中均勻生長；專性厭氧菌只在試管培養基底部生長；兼性厭氧菌在試管培養基接近表面及上部生長旺盛，但是在試管中下部也有少量生長；微好氧菌在試管培養基中部生長；好氧菌只在試管培養基表面生長。

2 結果與分析

2.1 拮抗細菌分離

37 ℃生化培養箱中培養1 d后，挑取平板中顏色和菌落形態不同的單菌落劃線純化，得到了6個細菌純培養用于后續的拮抗活性測定。

2.2 抑菌譜測定

待對照中兩病原菌菌絲長到平板中央時，記錄抑菌帶直徑。結果顯示分離出的6個菌株中，其中一個菌株抑菌譜廣，抑菌活性較強，故將其命名為XZ-1。如圖1所示，XZ-1對8種指示植物病原真菌均有較強的抑制效果，均顯示出了非常明顯的抑菌帶。抑菌帶直徑測定結果如表1所示，XZ-1對大蒜葉枯病菌和絲瓜炭疽病菌的抑制作用最強，其抑菌帶直徑分別為21.1 mm和22.7 mm；對草莓炭疽病菌等其他6種病原真菌的抑菌效果其次，但其抑菌帶直徑均大于10.0 mm。

A、B、C、D、E、F、G、H的指示病原菌分別為大蒜葉枯病菌、草莓炭疽病菌、甘薯干腐病菌、絲瓜炭疽病菌、甜瓜枯萎病菌、小麥全蝕病菌、小麥紋枯病菌及大豆菌核病菌。每個圖中左邊平板為對照，右邊平板為XZ-1處理。

圖1 XZ-1的拮抗活性測定結果

2.3 16S rDNA擴增及系統進化樹的構建

PCR擴增XZ-1菌株的16S rDNA片段，電泳檢測出約為1400 bp的擴增產物(圖2)。經測序后序列比對以及構建的基于16S rDNA的系統發育進化樹

如圖3所示，XZ-1菌株與解淀粉芽孢桿菌聚為一簇，由此，我們初步將該菌株鑒定為解淀粉芽孢桿菌。

圖2 XZ-1 16S rDNA PCR擴增產物電泳圖

圖3 基于16S rDNA 序列的XZ-1系統發育進化樹

2.4 XZ-1的生物學特性

2.4.1 pH 值對XZ-1生長的影響 在pH為5、6、7、8、9、10、11和12等8個梯度的LB液體培養基中，XZ-1在pH為5、6、7、8的培養基中生長較好，其OD600分別為0.685、0.710、0.584、0.541；在pH為9的條件下生長較差，其OD600為0.200；在pH為10、11、12條件下基本不生長，其OD600分別為0.052、0.056、0.052(圖4)。

圖4 不同pH值對XZ-1生長的影響

2.4.2 氯化鈉濃度對XZ-1生長的影響 如圖5所示，XZ-1隨著氯化鈉濃度的增加，其生長先加快后逐漸被抑制。在供試的6種氯化鈉梯度濃度的LB液體培養基中，XZ-1在氯化鈉濃度為5 g/L時生長情況相對較好，其OD600為0.900；在氯化鈉濃度為10～25 g/L時，XZ-1隨著鹽濃度的升高生長逐漸被抑制。

圖5 不同Nacl濃度對XZ-1生長的影響

2.4.3 光照條件對XZ-1生長的影響 從圖6可以看出，XZ-1在不同的光照和黑暗處理方式下生長狀況無較大差異，其OD600分別為0.800、0.792、0.821。總體而言，XZ-1菌株對光照的敏感性不強。

1：12 h光照和12 h黑暗；2：24 h光照；3：24 h黑暗。

2.4.4 XZ-1的致死溫度 調查結果顯示，經過90 ℃及以下溫度水浴處理10 min 后涂板，在LBA 培養基上仍能長出菌落；而經過100 ℃、10 min處理后涂板，在LBA 培養基上看不到菌落的形成。由此確定該菌株的致死溫度為100 ℃、10 min。

2.4.5 XZ-1生長對O2的需求 從48 h后開始觀察XZ-1在試管內的生長狀況，直至10 d，結果均顯示XZ-1在試管培養基接近表面及上部生長旺盛，培養基中下部也有少量生長，由此鑒定該菌株為兼性厭氧菌。

3 討論與結論

近年來，解淀粉芽孢桿菌是研究生物防治的熱門菌種之一，由于其能夠分泌多種抑菌物質[15]，有顯著的促生作用[16]，并且具有誘導作物產生抗性能力等優點已得到廣泛的應用與報道[17-21]。本研究從36份土樣中篩選出6株拮抗細菌，其中菌株XZ-1抑菌效果顯著且抑菌譜廣。平板對峙試驗表明，XZ-1的發酵液對供試的8種重要農作物病害的病原菌有非常顯著的抑菌活性，其抑菌圈均大于10 mm。經16 S rDNA片段擴增以及系統發育進化樹的構建，初步將該細菌鑒定為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)。進一步的生物學特性研究結果表明，XZ-1在pH值為6時生長最佳，在pH值為8時仍然能夠較好地生長，說明該菌株具有較好的耐弱堿能力；在氯化鈉濃度為0～10 g/L之間的生長情況相對較好，在氯化鈉濃度為25 g/L時，OD600仍然能達到0.579，表明該菌株具有較好的耐鹽性；致死溫度為100 ℃、10 min，表明該菌株具有較好的高溫抗性。由此，該生物學特性研究結果可為XZ-1的應用環境條件奠定理論基礎。

綜上所述，本課題組篩選出的生防菌株解淀粉芽孢桿菌XZ-1具有抑菌能力強、抑菌范圍廣、環境適應性強等特點，尤其比較適合于高溫高鹽以及中性、弱堿性土壤地區的應用推廣。進一步探索該菌株的田間防治效果以及抑菌機理，可為開發新的生防菌劑奠定理論基礎，為農作物病害生物防治作出貢獻。

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(責任編輯：許晶晶)

Isolation and Identification of A Strain ofBacillusamyloliquefaciensand Its Biological Characteristics

YANG Dong-jing, ZHANG Cheng-ling, XU Zhen, ZHAO Yong-qiang, SUN Hou-jun, XIE Yi-ping*

(Xuzhou Institute of Agricultural Sciences in Xuhuai Area of Jiangsu / Key Laboratory of Sweet Potato Biology and Genetic Improvement, Ministry of Agriculture, Xuzhou 221131, China)

In this study, we isolated a strain of antagonistic bacterium with broad-spectrum antimicrobial activity from soil, which was named as XZ-1. The antagonistic activity of XZ-1 was tested by using the method of plate confrontation culture, and the results showed that XZ-1 had strong antagonistic activity against eight kinds of plant pathogenic fungi, such asPleosporaherbarum,Colletotrichumfragariaeand so on, and the diameter of inhibition zone was all more than 10 mm. The 16S rDNA fragment of XZ-1 was amplified by PCR, its phylogenetic tree was constructed by MEGA 6.0, and this strain was preliminarily identified asBacillusamyloliquefaciens. Single-factor experimental design was adopted to study the biological characteristics of XZ-1, and the results indicated that: the best pH-value for the growth of XZ-1 was 6, and the suitable salinity for its growth was 0～10 g/L sodium chloride; XZ-1 was not sensitive to light and darkness; the lethal temperature was 100 ℃ for 10 min.

Bacillusamyloliquefaciens; Antagonistic activity; Biological characteristics

2017-05-14

國家現代農業產業技術體系建設專項(CARS-11-B-09)。

楊冬靜(1983─)，女，四川射洪人，助理研究員，碩士，主要從事植物病理學研究。*通訊作者：謝逸萍。

S476

A

1001-8581(2017)09-0069-06