中華結縷草對潮霉素的敏感性研究

劉建華,裴福云,宋鳳鳴,雷江麗

(1.廣東省深圳市鐵漢生態環境股份有限公司,廣東 深圳 518040;2.廣東省深圳市中科院仙湖植物園/廣東省深圳市南亞熱帶植物多樣性重點實驗室,廣東 深圳 518004)

中華結縷草對潮霉素的敏感性研究

劉建華1,裴福云1,宋鳳鳴1,雷江麗2*

(1.廣東省深圳市鐵漢生態環境股份有限公司,廣東 深圳 518040;2.廣東省深圳市中科院仙湖植物園/廣東省深圳市南亞熱帶植物多樣性重點實驗室,廣東 深圳 518004)

研究了中華結縷草3種不同外植體對不同濃度潮霉素溶液的敏感性。結果表明:中華結縷草不同外植體對潮霉素的敏感性存在差異，其中種子經50 mg/L潮霉素處理3周后,發芽率極顯著減少,只有6%;愈傷組織經20 mg/L潮霉素處理3周后褐化率達到62%；離體葉片經50 mg/L潮霉素處理7 d后,黃化面積率超過85%。故中華結縷草的種子、愈傷組織、離體葉片在遺傳轉化中適宜的潮霉素篩選濃度分別為50、20、50 mg/L。

中華結縷草;潮霉素;敏感性;外植體

中華結縷草(ZoysiasinicaHance)作為我國的鄉土品種,在枝條密度、抗寒性、耐熱性、抗旱性、葉子質地等方面均位于同類暖季型草種的前列[1],而且分布區域廣泛,管理成本低,其中需水量更是只有草地早熟禾的50%左右,因而無論是在北方還是在南方均有大面積種植[2]。隨著對中華結縷草研究的深入和應用范圍的擴大,越來越多的學者開始關注中華結縷草的轉基因育種,在遺傳轉化的報道中遺傳介導的載體包含種子[3-4]、愈傷組織[5-6]等,且目前主要集中在耐寒[6-7]的研究。

在植物遺傳轉化中,選擇合適的篩選標記基因往往能達到事半功倍的效果。用抗生素進行轉基因植物陽性材料篩選,已是一種較為快速有效的措施,在前期篩選和后代材料鑒定上使用廣泛,目前已在小麥[8]、大豆[9]、楊樹[10]等上成功應用。潮霉素B (Hygromycin B)是一種氨基糖苷類抗生素,可破壞各種細胞中核糖體的功能,使敏感組織褐化死亡。潮霉素B因其具有選擇率高、假陽性率低、重復性好、對轉化細胞毒害作用小等優點而被重視[11-14],在單子葉植物上得到了廣泛應用[15-17]。目前國家對轉基因植物安全性的重視也促使育種工作者選用更安全的篩選標記基因。HPT編碼蛋白對人體潛在致敏性很低[18],是一種較安全的標記基因。本文采用愈傷組織、種子、離體葉片這3種不同的外植體，研究了它們對潮霉素的敏感性,以期為中華結縷草轉基因各階段的篩選提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料

中華結縷草草籽:采集于山西省沂蒙山區。中華結縷草植株:苗齡在3個月左右。潮霉素B：生產廠家為羅氏制藥,儲存液濃度為50 mg/mL。

1.2 培養基與培養條件

人工氣候箱的培養條件為:溫度(25±2)℃、光照強度2000～2500 lx、光照時數16 h/d。愈傷組織的誘導培養基配方為MS+2 mg/L 2,4-D+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂,并用NaOH調節pH至5.8。

1.3 實驗方法

1.3.1 潮霉素對種子的處理方法 挑選飽滿成熟的種子,各處理均先進行催芽處理:用10%的NaOH處理20 min,再用清水沖洗5遍。然后進行消毒處理:用75%的酒精消毒1 min,然后用0.1%升汞消毒10 min,最后用無菌水清洗5遍左右。將經消毒的種子置于鋪有濾紙的培養皿中，并加入相應濃度的潮霉素溶液,最后放入人工氣候箱中培養。在試驗處理中每3 d更換1次相應濃度的潮霉素溶液。本試驗共設計了5個潮霉素濃度,分別為0、10、30、50、80 mg/L,每個處理100粒種子,均10次重復,其中0 mg/L為對照組。參照國標牧草種子檢驗規范的判定標準[19],在第3周記錄發芽數并按下列公式計算發芽勢和發芽率。

發芽勢(%)=第2周的發芽數/種子數×100;

發芽率(%)=第3周的發芽數/種子數×100。

1.3.2 潮霉素對愈傷組織的處理方法 對供試種子進行消毒并將其接種到誘導培養基中,每3周轉接1次；到第3次時,將愈傷組織放入含有潮霉素溶液的誘導培養基中,其中潮霉素濃度分別為0、20、50、80、100 mg/L。每個處理5個樣品,均10次重復,其中0 mg/L為對照組。每周進行觀察記錄,3周后統計相關數據并計算分化率、存活率和褐化率，其中褐化率的計算公式如下：

褐化率(%)=褐化數/樣品數×100。

1.3.3 潮霉素對離體葉片的處理方法 經過預實驗可知,離體條件下葉片在0.5 mg/L的6-BA溶液中能保證1周不明顯變黃,故處理時均加入6-BA以增加其綠葉時間。試驗開始時,共設置5個潮霉素濃度處理,分別為0、50、100、150、200 mg/L,溶劑為含6-BA的蒸餾水,其中0 mg/L為對照組。取正常生長的成熟葉片(在新葉后的第1～2片真葉),用剪刀剪去葉片兩端并留取寬度在1.0～1.5 cm的葉片片段,最后把葉片段隨機放置到各個處理溶液中,放入人工氣候箱培養。每2 d觀察記錄1次,并在第6天統計每張葉片段的黃化面積率。

黃化面積率(%)=黃化面積/葉面積×100。

1.4 數據統計與分析

采用Excel 2013進行圖表制作,采用SPSS 23.0軟件對發芽率、存活率、黃化率等進行單因素方差分析,選用Duncan法進行多重比較,顯著性水平設置為0.01。

2 結果與分析

2.1 潮霉素對中華結縷草種子發芽勢、發芽率的影響

發芽勢是測試種子發芽速度和整齊度的一個指標。從圖1可以看出,經過潮霉素處理后，中華結縷草種子的發芽勢和發芽率都不同程度的降低；10 mg/L潮霉素處理的影響不顯著;當潮霉素濃度達到30 mg/L時發芽率只有22%，與對照有極顯著差異;當潮霉素濃度達到50 mg/L時,發芽率為6%,發芽勢為4%,說明此時種子發芽已受到嚴重抑制;當潮霉素濃度繼續升高至80 mg/L時,發芽率和發芽勢均趨近于0%。故為了防止藥劑濃度過高導致的生長毒害作用且為了滿足較高的篩選效率,選用50 mg/L的潮霉素濃度作為種子的篩選標準。

圖中不同大寫英文字母表示處理間差異達P<0.01的顯著水平。下同。

2.2 潮霉素對中華結縷草愈傷組織的影響

合適的潮霉素篩選濃度是保證基于組培途徑的植物轉基因技術成功的關鍵因子之一,直接影響后期的遺傳轉化效果和工作量。由圖2可知：隨著潮霉素濃度的提高和處理時間的延長,外植體的褐化率總體上呈上升趨勢。具體來說，在第2周時,除20 mg/L潮霉素處理外其他濃度處理均達到半致死濃度,而對照組變化不顯著。在處理3周后,20 mg/L潮霉素處理的愈傷組織達到半致死濃度；而50 mg/L處理下褐化率達到90%；隨著濃度繼續升高,褐化率雖小幅度下降但均保持在80%左右。實際觀察(圖3)發現：在50 mg/L潮霉素處理下,愈傷組織長勢急劇下降,幾乎停滯生長且愈傷組織質地變軟,顆粒不明顯,后續也不能繼續增殖和分化,毒害作用較大;在潮霉素處理下,前期愈傷組織的褐化識別較難,需經過3周左右才能結合顏色和愈傷組織大小進行綜合區分。故基于試劑成本與篩選效率的考慮,在實際應用時,可選取20 mg/L為愈傷組織培養的潮霉素篩選濃度。

圖2 不同潮霉素濃度對愈傷組織的影響

2.3 潮霉素對中華結縷草離體葉片的影響

經不同濃度的潮霉素處理7 d后,對各處理離體葉片的試驗數據進行統計和分析,結果如圖3所示。從圖3可以看出：各處理與對照間的黃化面積率均存在極顯著差異；當潮霉素濃度達到50 mg/L時,黃化面積率已經超過85%,藥害癥狀明顯(參見圖4);當潮霉素濃度超過50 mg/L后,葉片黃化面積較50 mg/L處理略有減少。綜上分析,認為50 mg/L的潮霉素濃度較適合作為轉基因后代耐藥性篩選的條件,它可以在節省成本的同時得出一個辨識度高的結果,方便得出結論。

左圖：潮霉素濃度0 mg/L;右圖：潮霉素濃度50 mg/L。

圖4 不同潮霉素濃度處理下葉片的黃化面積率

從左到右依次為潮霉素濃度0、50、100、150、200 mg/L。

3 討論與結論

本研究結果表明，中華結縷草對潮霉素有一定抗性,且不同外植體的耐性不同,其中種子、愈傷組織、離體葉片的篩選濃度分別為50、20、50 mg/L。前人的研究表明,種子的篩選濃度稍高于葉片、莖段、愈傷組織等外植體的[20]。本文中中華結縷草葉片和種子的篩選濃度相近,可能是由于葉片的疏水作用且切口較小,故減輕了藥劑的毒害;葉片處理時間較短,故對濃度要求較高。種子作為轉基因后代材料,往往需其萌發成苗后才能進行檢測。通過抗生素對種子進行檢測,有效地縮短了檢測時間間隔,也顯著降低了工作量[15]。離體葉片檢測由于取材方便、效果直觀、檢測成本小、可信度較高[21],可作為轉基因后代檢測的一種輔助方法。愈傷組織檢測由于其培養時間長、對外界條件敏感，故還需根據實際情況對潮霉素的篩選濃度和篩選時間進行優化,防止其細胞大量死亡而無法正常增殖、分化。

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(責任編輯:黃榮華)

Study on Sensitivity ofZoysiasinensisto Hygromycin

LIU Jian-hua1, PEI Fu-yun1, SONG Feng-ming1, LEI Jiang-li2*

(1. Shenzhen Techand Ecology & Environment Company Limited in Guangdong Province, Shenzhen 518040, China; 2. Fairylake Botanical Garden, Shenzhen & Chinese Academy of Sciences / Shenzhen Key Laboratory of Southern Subtropical Plant Diversity, Shenzhen 518004, China)

The sensitivities of 3 types of explants ofZoysiasinensisto different concentrations of hygromycin solution were studied. The results showed that the sensitivities of different explants ofZ.sinensisto hygromycin were different. Three weeks after the seeds were treated with 50 mg/L hygromycin, their germination rate was very significantly reduced to only 6%. Three weeks after the calluses were treated with 20 mg/L hygromycin, their browning rate reached 62%. Seven days after the isolated leaves were treated with 50 mg/L hygromycin, their yellowing area rate exceeded 85%. Therefore, the optimum concentration of hygromycin for the screening of seed, callus and isolated leaf ofZ.sinensisin genetic transformation was 50, 20 and 50 mg/L, respectively.

Zoysiasinensis; Hygromycin; Sensitivity; Explant

2017-05-16

廣東省生態修復技術工程實驗室項目(粵發改高技術[2015]162號);立體綠化輕型基質研究工程實驗室項目(深發改 [2016]1023號)。

劉建華(1989─),男,重慶人,工程師,從事抗逆植物選育研究。*通訊作者:雷江麗。

S688.4

A

1001-8581(2017)09-0041-04