亞洲玉米螟高致病力球孢白僵菌菌株的分離篩選

孫藝昕+門興元+于毅+張思聰+夏小菊+葉保華+李麗莉

摘要：亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis（Guenée）是我國玉米生產(chǎn)上的重要害蟲，目前以化學(xué)防治為主。為尋求一種可持續(xù)的防治方法，本文從14株白僵菌菌株中初步篩選出對亞洲玉米螟致病力較強(qiáng)的6株白僵菌YB15、YB8、TB1126、TB1358、YB32、TB7，其致死中時間分別為0.66、1.44、1.29、0.99、1.42、1.28 d。同時測定了這6株白僵菌對亞洲玉米螟的致病力，從中篩選出產(chǎn)孢量大、萌發(fā)率高及毒力較強(qiáng)的球孢白僵菌YB15，在26℃條件下，該菌株濃度為1×109 孢子·mL-1時，亞洲玉米螟老熟幼蟲死亡率達(dá)到96.67%，感染僵死率達(dá)到73.33%。在亞洲玉米螟的生物防治中有很好的應(yīng)用潛力。

關(guān)鍵詞：亞洲玉米螟；白僵菌；菌株篩選；致病力

中圖分類號：S435.132 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2017）08-0111-04

Abstract The Ostrinia furnacalis （Guenée） （Lepidoptera： Crambidae） is an important insect pest of corn in China.Chemical control is the usual treatment method at present. To explore strategies for sustainable control of the pest population， the pathogenicity of 14 isolates of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana to mature larvae of Asian corn borer was tested under laboratory conditions. Six strains （YB15， YB8， TB1126， TB1358， YB32 and TB7） were selected for their high virulence and the shorter half lethal time （LT50） on mature larvae of O. furnacalis as 0.66， 1.44， 1.29， 0.99， 1.42 and 1.28 days respectively. The virulence against the mature larvae of O. furnacalis was compared between the 6 strains， and the results showed that YB15 strain exhibited the highest germination rate and sporulation and the strongest virulence. It could cause the corrected mortality of 96.67% and the cadaver rate of 73.33% after inoculation with 1×109 spores per milliliter at 26℃for 10 days. In conclusion， the strain YB15 has high application value for biological control of O. furnacalis.

Keywords Ostrinia furnacalis （Guenée）； Beauveria bassiana； Strain screening； Pathogenecity

亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis（Guenée）屬于鱗翅目Lepidoptera螟蛾科Crambidae，是一種世界性害蟲。其生存能力強(qiáng)，危害潛力大，主要危害玉米、高粱、谷子和棉花等，其中玉米受害最為嚴(yán)重，整個生育期均可受害，一般發(fā)生年份減產(chǎn)可達(dá)10%～20%，嚴(yán)重發(fā)生年份減產(chǎn)可達(dá)50%以上，甚至絕產(chǎn)[1，2]。近年來，隨著全球氣候變化，玉米螟的發(fā)生危害愈加嚴(yán)重，對我國糧食生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

針對玉米螟的防治方法有多種，目前仍以化學(xué)防治為主，但由于玉米螟發(fā)生后期，玉米植株較大，不方便施藥，防治效率很低或無法防治[1]。其他的物理、生物防治方法在當(dāng)前一家一戶種植模式下難以實(shí)現(xiàn)，相比之下，利用白僵菌作為植物內(nèi)生菌進(jìn)行生物防治是玉米螟防治的一種新途徑。白僵菌（Beauveria bassiana）致病力強(qiáng)，寄生范圍廣，有較高的開發(fā)潛力和應(yīng)用價值，是現(xiàn)階段研究和應(yīng)用較多的昆蟲生防菌[3]。近年的研究表明，球孢白僵菌具有植物內(nèi)生性，能夠在自然狀態(tài)或通過人工接種-灌根[4， 5]、包衣[6]、浸種[4，5]、葉面噴霧[7]等方式定殖在植物中，提高植物的抗病蟲能力[8]。因此，對玉米螟高效白僵菌菌株的篩選可以為白僵菌作為內(nèi)生菌應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

目前，許多科研工作者都進(jìn)行了玉米螟高致病力白僵菌菌株的篩選，徐艷聆等（2010）[9]從5個田間野生菌株中篩選出2株高毒力菌株；徐文靜等（2011） [2]、田志來等（2010） [10]也分別從吉林省玉米螟僵蟲中分離篩選獲得高效菌株，為白僵菌防治玉米螟的規(guī)模化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。但有研究表明，玉米螟分布廣，生物學(xué)特征地理變異大[11]，因此不同地區(qū)應(yīng)盡量在本地白僵菌菌株中篩選優(yōu)良菌株用于防治。鑒于此，筆者選用亞洲玉米螟老熟幼蟲，測定在山東田間采集純化獲得的14個球孢白僵菌菌株對其致病力，篩選防治亞洲玉米螟高效白僵菌菌株，為亞洲玉米螟防治提供新的生物防治資源，也為白僵菌作為玉米內(nèi)生菌防治亞洲玉米螟提供菌株資源。

1 材料與方法endprint

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 供試菌株為球孢白僵菌，采自山東各地，共14株（表1），保存于本實(shí)驗(yàn)室。所有供試菌株均采用PDA培養(yǎng)基[12]在 25～28℃下培養(yǎng)活化備用。

1.1.2 供試蟲源 供試蟲源為連續(xù)培養(yǎng)多代的穩(wěn)定的亞洲玉米螟實(shí)驗(yàn)室種群，在溫度（26±1） ℃、光周期14 L∶10 D、濕度60%～80%的人工氣候室內(nèi)人工飼料飼養(yǎng)[13]。選取健康老熟幼蟲作為供試蟲源。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)率的測定 將供試菌株接種到PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d后，在距平皿邊緣等距離處隨機(jī)打取3塊直徑為8 mm的菌塊，加入0.5%吐溫-80無菌水20 mL，磁力攪拌均勻后用血球計數(shù)板測定菌液含孢量[14]。

配制含0.05%吐溫-80、2.0%蔗糖和0.5%蛋白胨的培養(yǎng)液，將PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)的白僵菌孢子刮入上述培養(yǎng)液中，攪拌均勻后，將孢子濃度調(diào)至1.0×105 孢子·mL -1。于25℃下120 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h。取樣鏡檢測定孢子萌發(fā)率[14]。

1.2.2 高致病力菌株的初篩 將供試菌株接種至凍存管中，待其長滿PDA表面后，將20頭健康亞洲玉米螟老熟幼蟲接入凍存管中，用紗布封口，飼喂人工飼料[13]，使用PDA培養(yǎng)基作為對照。每天觀察記錄幼蟲死亡數(shù)并更換飼料，直至玉米螟全部死亡或化蛹，計算致死中時間。每處理重復(fù)3次。

1.2.3 高致病力菌株的復(fù)篩 采用幼蟲浸漬法。將從上述試驗(yàn)中篩選出的高致病力菌株接種在PDA培養(yǎng)基平板上，置于26℃人工氣候箱恒溫培養(yǎng)10 d左右，用0.1%吐溫-80無菌水洗脫孢子，使用血球計數(shù)板計數(shù)配制母液[15]，然后依次稀釋至1.0×109、1.0×108、1.0×107、1.0×106、1.0×105 孢子·mL-1的孢子懸浮液。

取20頭大小均勻的玉米螟老熟幼蟲浸入上述配好的孢子懸浮液中，5 s后取出，用濾紙吸干多余水分，放入備好人工飼料的養(yǎng)蟲盒中飼養(yǎng)。每日更換飼料，連續(xù)觀察 10 d，逐日統(tǒng)計不同濃度下幼蟲死亡數(shù)。以鑷子接觸蟲體不動為死亡。死亡的幼蟲取出放入消毒后的培養(yǎng)皿中，保濕后觀察蟲體，以蟲尸上長出肉眼可見的菌絲及孢子計為僵蟲，統(tǒng)計致死中濃度、死亡率及僵蟲率。每處理重復(fù)3 次。以 0.1% 吐溫-80溶液作為對照。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計軟件SPSS 16.0處理，根據(jù)校正死亡率進(jìn)行概率值轉(zhuǎn)換后，對劑量進(jìn)行線性回歸分析，建立直線回歸模型，從而分別估計劑量效應(yīng) LT50 、LC50等參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 球孢白僵菌的產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)率

14株白僵菌的產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)率見表2，可知，菌株YB15的產(chǎn)孢量最高，為15.24×106孢子·mL-1，孢子萌發(fā)率也達(dá)到90.00%； YB27和YB8產(chǎn)孢量次之，分別為12.88×106孢子·mL-1 和10.94×106孢子·mL-1；TB1127的產(chǎn)孢量最低，為1.04×106孢子·mL-1。各菌株的孢子萌發(fā)率均達(dá)到80%以上。

2.2 對亞洲玉米螟高致病力球孢白僵菌菌株的初篩

14株球孢白僵菌對亞洲玉米螟老熟幼蟲的致死中時間見表3，可知，各菌株的致死中時間LT50為0.66～ 3.40 d，其中YB15、YB8、TB1358、TB1126、TB7和YB32對玉米螟的致死中時間均在2 d內(nèi)，對玉米螟的毒性較強(qiáng)。

2.3 對亞洲玉米螟高致病力球孢白僵菌菌株的復(fù)篩

球孢白僵菌菌株TB7、TB1126、TB1358、YB8、YB15和YB32對亞洲玉米螟老熟幼蟲的致死中濃度見表4，可知，YB15的LC50最低，為2.51×106孢子·mL-1，說明YB15對亞洲玉米螟的致病力最強(qiáng)。

統(tǒng)計各菌株最高濃度（1×109孢子·mL-1）對試蟲的校正死亡率及僵蟲率結(jié)果見表5，可知，YB15在1×109 孢子·mL-1濃度下第10 d亞洲玉米螟的死亡率達(dá)到96.67%，僵蟲率達(dá)到73.33%；YB8在1×109 孢子·mL-1下第10 d亞洲玉米螟的死亡率達(dá)到90.00%，僵蟲率達(dá)到53.33%；其余幾個菌株對亞洲玉米螟的死亡率均在80%以下，僵死率均在35%以下。說明，YB15對亞洲玉米螟的致病力最強(qiáng)。

3 討論與結(jié)論

玉米螟是玉米上的重要害蟲，目前對其防治仍以化學(xué)防治為主，不僅污染環(huán)境，同時造成玉米的農(nóng)藥殘留，而且在玉米生長后期，化學(xué)防治很難實(shí)現(xiàn)，玉米螟的危害不僅直接引起玉米減產(chǎn)，還可誘發(fā)玉米穗腐病的發(fā)生，因此，生產(chǎn)中急需尋找更加適合的防治方法。白僵菌是廣譜性昆蟲致病真菌，被越來越多地應(yīng)用于農(nóng)林害蟲的防治，篩選對玉米螟高毒力的白僵菌菌株可以大大提高對玉米螟的防治優(yōu)勢。本研究室內(nèi)生測結(jié)果表明，采自山東的14個供試白僵菌菌株對玉米螟老熟幼蟲均具有不同程度的侵染致病能力，但菌株之間差異較大。初步篩選出的6個菌株對亞洲玉米螟的致死中時間均小于2 d，作用效果普遍較快。菌株YB15在1×109 孢子·mL-1濃度條件下、接種后第10 d對玉米螟老熟幼蟲的校正死亡率最高，達(dá)96.67%，僵蟲率達(dá)73.33%，具有較好的應(yīng)用前景。

白僵菌等微生物制劑的應(yīng)用可以有效降低化學(xué)農(nóng)藥的使用量，充分發(fā)揮自然因子對田間害蟲的控制力度，保護(hù)生態(tài)環(huán)境。除直接用于防治害蟲外，還可將白僵菌接種到玉米、高粱等作物中提高作物對螟蟲的抗性[5，16]。本研究篩選獲得山東省內(nèi)對亞洲玉米螟致病力較強(qiáng)的白僵菌菌株，后續(xù)將針對白僵菌的田間應(yīng)用及作為玉米內(nèi)生菌開展相關(guān)研究。

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