寡聚核苷酸FISH在鑒定小麥—單芒山羊草種質中的應用

宮文萍+李建波+李豪圣+宋健民+劉愛峰+曹新有+韓冉+程敦公+趙振東+楊足君+劉成+劉建軍

摘要：在小麥-單芒山羊草雜交種質鑒定研究中，尚缺乏可同時鑒定小麥和單芒山羊草染色體的細胞遺傳學方法。本研究用寡聚核苷酸Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa-535-1為探針的雙色FISH和以（GAA）8為探針的單色FISH分別對小麥-單芒山羊草雙二倍體、中國春-單芒山羊草附加系進行分析，建立了可以同時鑒定小麥和單芒山羊草全部染色體的FISH標準核型。同時，利用建立的FISH標準核型在1N附加系自交后代材料中發現了5BS.3BS和5BL.3BL易位，在5N附加系自交后代中發現5NL端部寡聚核苷酸序列刪除現象，這為研究染色體結構變異與表型變化的關系等提供了研究材料。此外，還在4N附加系自交后代中發現4B染色體丟失現象，造成該附加系自發形成4N（4B）代換系，為誘導產生涉及4N染色體的小麥-單芒山羊草羅伯遜易位系奠定了基礎。

關鍵詞：單芒山羊草；熒光原位雜交；染色體結構變異；代換系

中圖分類號：S5121：Q78 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2017）08-0012-07

Abstract So far，the cytogenetic approaches for the identification of wheat-Aegilops uniaristata germplasm are lacking. In the present research， Fluorescence in situ hybridization （FISH） using Oligo-pTa535-1 and Oligo-pSc119.2-1 as probes， and FISH using （GAA）8 as probe are performed on wheat-Ae. uniaristata amphiploid and additions. As a result， a standard FISH pattern was established for the identification of all chromosomes of wheat and Ae. uniaristata simultaneously. Meanwhile， chromosome translocations 5BS.3BS and 5BL.3BL were detected in the self-pollinated 1N addition progenies， and oligo-nucleotide sequence deletion was also detected on chromosome arm 5NL of Ae. uniaristata in the self-pollinated 5N addition progenies， providing important material for researching the relationships between chromosome structure variation and phenotypic changes. Moreover，a spontaneously formed wheat-Ae. uniaristata 4N（4B） substitution line was identified by the established FISH karyotype from the self-pollinated 4N addition progenies， making a solid foundation for further inducing wheat-Ae. uniaristata chromosome translocations with chromosome 4N involved.

Keywords Aegilops uniaristata；Fluorescence in situ hybridization；Chromosome structure aberration； Substitution line

小麥是我國50%～60%城鄉居民的主要口糧，全國年消費量約1.05億噸，占全球消費量的20%左右。由于人們生活水平和對生活品質的要求不斷提高，使得小麥產業不僅要培育和推廣高產抗病品種，還要培育優質特色品種，以滿足市場的多元化需求。由于小麥白粉病、條銹病和赤霉病等嚴重影響小麥生產，加上小麥優質特色育種種質資源有限，因此，發掘優異新基因和創制特異種質新資源并將其轉移給當前小麥是培育多元化小麥新品種的重要物質基礎。

山羊草屬物種含有小麥育種所需的抗病抗逆和優質等基因，其中的單芒山羊草抗小麥多種病害[1-4]，具有耐逆性[5]，具有優質育種潛力[6]，是改良小麥的優異基因源。由于小麥與部分山羊草屬物種的親緣關系非常近，如小麥D染色體來源于粗山羊草[7]，小麥B染色體來源于擬斯卑爾脫山羊草[8-10]，因此，小麥與山羊草屬部分物種容易雜交成功并獲得小麥-山羊草雙二倍體/部分雙二倍體。將山羊草種質轉移給小麥的常規步驟是：山羊草雙二倍體/部分雙二倍體與小麥雜交回交獲得染色體附加系，附加系經染色體工程誘導獲得代換系，代換系經染色體工程誘導成羅伯遜易位系，羅伯遜易位系直接應用于小麥育種或再經染色體工程誘導成染色體小片段易位系再應用于小麥育種。目前，我們已獲得抗小麥條銹病的小麥-單芒山羊草1N附加系和可顯著提高小麥品質的小麥-單芒山羊草4N染色體附加系[11]，然而涉及1N和4N染色體的相應代換系還未獲得。

小麥-單芒山羊草雙二倍體和全套附加系已經被創制出來[11]，并且單芒山羊草基因組的優異基因也被進行了充分發掘[12]。然而，目前鑒定小麥背景中單芒染色體的方法十分有限。研究發現以寡聚核苷酸（GAA）8為探針的單色熒光原位雜交（FISH）可以對小麥背景中的單芒山羊草進行區分，但是不能鑒定小麥全部染色體[13]。以寡聚核苷酸Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa-535-1為探針的雙色FISH可以有效區分小麥全部A、B和D染色體[14]，但是是否能區分單芒山羊草1N～7N染色體尚未可知。為此，本研究特以寡聚核苷酸Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa-535-1為探針的雙色FISH和以（GAA）8為探針的單色FISH對小麥-單芒山羊草雙二倍體和附加系進行分析，以期建立能夠同時鑒定清楚小麥及單芒山羊草所有染色體、用于染色體結構變異檢測和可廣泛應用小麥-單芒山羊草種質資源鑒定的雙色-單色順序FISH方法。endprint

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗于2017年在山東省農業科學院作物研究所農業部黃淮北部小麥生物學與遺傳育種重點實驗室/小麥玉米國家工程實驗室和電子科技大學生命科學與技術學院植物細胞遺傳實驗室進行。試驗材料小麥中國春（Chinese Spring，簡寫為CS，2n=6x=42，基因組AABBDD）由電子科技大學生命科學與技術學院李光蓉教授提供。圓錐小麥-單芒山羊草雙二倍體（TA3401，2n=6x=42，基因組AABBNN）由美國堪薩斯州立大學小麥遺傳與基因資源中心Friebe Bernd教授提供。1N～5N附加系和7N附加系由英國John Inne Centre的Steve Reader教授提供。

試驗所用探針Oligo-pSc119.2-1、Oligo-pTa-535-1、（GAA）8均由成都瑞信生物公司合成，前兩者序列同文獻[14]。

1.2 染色體制片與原位雜交

將種子置于鋪有濾紙且濕潤的培養皿中，放入22℃的恒溫光照培養箱中。待種子萌動后，將培養皿轉到4℃冰箱中放置24 h，之后，放入22℃恒溫光照培養箱培養，待種子根尖長至1～2 cm時，剪下根尖，用冰水處理 22～24 h。倒出冰水，用固定液（無水乙醇∶冰醋酸=3∶1，體積比）固定根尖7 d以上，壓片備用。染色體壓片技術參見文獻[15]，熒光原位雜交方法參見文獻[14，16]，雜交順序為先用寡聚核苷酸探針Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa-535-1對供試材料染色體制片進行雙色熒光原位雜交，照相后洗脫Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa-535-1的熒光信號，然后再利用探針（GAA）8對同一細胞進行雜交照相。

2 結果與分析

2.1 小麥-單芒山羊草雙二倍體FISH分析

利用探針Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa-535-1對圓錐小麥-單芒山羊草雙二倍體進行雙色熒光原位雜交，結果發現，雙色FISH可以一次鑒定清楚圓錐小麥染色體（圖1A），剩余7對單芒山羊草染色體信號各不一致（圖1A），但無法確定其同源群歸屬。因為（GAA）8為探針的單色FISH可以一次鑒定清楚單芒山羊草染色體同源群歸屬[11]，因而本研究對上述雙色FISH染色體制片進行信號洗脫，再以（GAA）8對其進行FISH分析，確定單芒山羊草染色體同源群歸屬（圖1B）。

為了更好地描述Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa-535-1在單芒山羊草染色體上的雜交信號，筆者對單芒山羊草1N～7N染色體FISH圖進行了提取處理（圖2）。其中，1N染色體兩端都有較強的Oligo-pSc119.2-1信號（綠色），在長臂末端和近末端有Oligo-pTa-535-1信號（紅色）；2N染色體短臂末端有較弱的Oligo-pSc119.2-1信號，近著絲粒和長臂亞端部均有很強的Oligo-pSc119.2-1信號，著絲粒處和長臂近末端有Oligo-pTa-535-1信號；3N染色體短臂末端有非常強的Oligo-pSc119.2-1信號，長臂末端、近末端有Oligo-pTa-535-1信號；4N染色體短臂末端、長臂末端和長臂近末端均有很強的Oligo-pSc119.2-1信號；5N染色體長臂和短臂末端均具有Oligo-pSc119.2-1信號，長臂近末端和亞端部均有Oligo-pTa-535-1信號；6N染色體短臂末端具有Oligo-pSc119.2-1信號，長臂末端具有Oligo-pTa-535-1信號；7N染色體短臂末端具有Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa-535-1信號，長臂近著絲粒和長臂亞端部有較強的Oligo-pTa-535-1信號。

2.2 小麥-單芒山羊草附加系自交后代材料FISH分析

為了研究小麥-單芒山羊草附加系自交后代染色體結構是否發生變異，本研究利用探針Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa-535-1對小麥-單芒山羊草1N～5N和7N附加系自交后代進行原位雜交，結果發現，小麥-單芒山羊草2N、3N、5N和7N附加系中所有小麥染色體雜交信號和文獻[14]報道的完全一致，染色體結構未發現變異，且寡聚核苷酸在染色體上的雜交位置及信號也完全一致，然而，1N附加系自交后代中發現了5BS.3BS和5BL.3BL易位（圖3A、3B）。小麥-單芒山羊草4N附加系自交后代中發現1對4B染色體丟失，該附加系自發形成了4N（4B）代換系（圖3E、3F）。供試的小麥-單芒山羊草附加系中，1N～4N和7N雜交信號和本研究以Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa-535-1為探針建立的單芒山羊草FISH核型（圖2）完全一致。5N染色體在雙二倍體中長臂和短臂末端均具有Oligo-pSc119.2-1信號，長臂近末端有Oligo-pTa-535-1信號；而在5N附加系自交后代中，染色體5N長臂末端的Oligo-pSc119.2-1信號丟失（圖3C），這說明5N在傳遞過程中寡聚核苷酸Oligo-pSc119.2-1序列發生了刪除。

利用探針（GAA）8對小麥-單芒山羊草1N～5N和7N附加系自交后代進行原位雜交，結果認為除小麥-單芒山羊草4N附加系自交后代中4B染色體丟失外，未發現其它所有小麥和單芒染色體寡聚核苷酸（GAA）8序列刪除現象，并且其在染色體上的雜交位置和信號強度均未發生變異（圖3B、3D和3F）。

3 討論與結論

在單芒山羊草染色體鑒定方面，Friebe等[17]、Badaeva等[18]和Gong等[11]先后建立了不同來源的單芒山羊草染色體C分帶，提供了鑒定單芒山羊草染色體的細胞遺傳學方法，然而，影響該方法穩定性的酸、堿、鹽濃度等因素太多，并不適用于所有實驗室。Gong等[11]建立了單芒山羊草染色體（GAA）8為探針的FISH核型，然而，該方法僅能鑒定單芒山羊草染色體，但不能鑒定小麥全部染色體，因而，在小麥-單芒山羊草雜交種質鑒定方面不具全面性。雖然單芒山羊草3N染色體特異EST-STS標記[19]、1N染色體麥谷蛋白標記[20]和1N～7N染色體EST-STS、PLUG和COS標記[11]已經建立起來，為檢測小麥背景中單芒山羊草染色體提供了檢測方法，但仍不能一次性鑒定清楚小麥-單芒山羊草種質的所有染色體。本研究以小麥-單芒山羊草雙二倍體為基礎，建立了以Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa-535-1為探針的可以同時鑒定小麥和單芒山羊草所有染色體的雙色FISH方法，有效彌補上述研究的不足。不僅如此，本研究建立的雙色FISH方法不僅可用于發現小麥-單芒山羊草自交后代中的染色體結構變異、序列刪除和染色體丟失等現象（圖3A～3F），還可以廣泛應用于小麥-單芒山羊草種質篩選與鑒定工作中。endprint

創制可用于小麥育種的小麥-外源物種染色體小片段易位系進行小麥遺傳改良是全世界小麥種質資源學家的終極追求。小麥-外源物種染色體單體附加[21]和輻射誘變[22]等方法均是獲得小麥-外源物種染色體小片段易位系的有效方法。然而，前者在不同物種染色體間易位頻率差異大[21，23，24]，后者誘導方法由于必須大量處理材料并且誘變的方向不可控，因此，較多學者還利用先誘導材料獲得小麥-外源物種羅伯遜易位系[25-27]，再利用ph1b基因誘導羅伯遜易位系獲得小片段易位系的兩步法來達到誘導目的[28]。利用上述兩步法的關鍵是獲得小麥-外源物種染色體雙單倍體，或先獲得小麥-外源物種代換系再與普通小麥雜交獲得雙單倍體。本研究利用建立的單芒山羊草FISH核型從小麥-單芒山羊草4N附加系自交后代中篩選鑒定出了自發產生的4N（4B）代換系。由于單芒山羊草4N染色體導入小麥可以提高小麥面團的穩定時間和形成時間，增加蛋白質和濕面筋含量[12]，因此，小麥-單芒山羊草4N（4B）代換系為誘導獲得可用于小麥品質育種的染色體小片段易位系提供了重要的物質基礎。

在小麥遠緣雜交后代中往往會出現染色體結構變異[29-33]。陳雷等[29]發現1BL/1RS易位染色體在后代傳遞過程中，可以引起小麥染色體6BS端部缺失和染色體1BL端部缺失。Garg等[30]在小麥Vilmorin27-中間偃麥草附加系的兩個衍生系中發現1D染色體的長臂發生斷裂缺失；Tang 等[31]和Fu等[32]在小麥-黑麥雜交種發現涉及小麥染色體5A、6A、1B、2B、6B、7B、1D、3D 和7D等染色體的結構變異。Garg等[33]發現小麥-長穗偃麥草1E附加系后代材料1D染色體丟失而自發形成1E（1D）代換系。本研究發現1N附加系自交后代中出現了小麥3B和5B染色體整臂易位，還在小麥-單芒山羊草5N附加系自交后代發現了寡聚核苷酸序列刪除現象。除此之外，在4N附加系后代材料發現小麥4B染色體自發丟失現象。本研究發現的小麥-單芒山羊草種質染色體結構變異體為后續研究染色體結構變異與表型關聯分析提供了研究素材。

參考文獻：

[1]Valkoun J，Hammer K，Kucˇerová D，et al. Disease resistance in the genus Aegilops L.—stem rust，leaf rust，stripe rust，and powdery mildew[J]. Die Kulturpflanze，1985，33（2）：133-153.

[2]McFadden E S，Sears E R. The genome approach in radical wheat breeding[J]. J. Am. Soc. Agron.，1947，39（11）：1011-1026.

[3]Mikhova S. Resistance of Aegilops species to Puccinia striiformis West f. sp. tritici in relation to ploidy and genome composition[J]. Genet. Selekt.，1988， 21（1）：15-20.

[4]Zhang X，Jin Y. Sensitivity to Ptr ToxA and tan spot infection responses in Aegilops/Triticum complex[J]. Can. J. Plant Pathol.，1998，20（4）：415-418.

[5]Iqbal N，Reader S M，Caligari P D，et al. The production and characterization of recombination between chromosome 3N of Aegilops uniaristata and chromosome 3A of wheat[J]. Heredity，2000，84（4）：487-492.

[6]宿振起，張改生，牛娜. 山羊草屬不同細胞質對小麥籽粒蛋白含量及組分的影響研究[J]. 西北植物學報，2005，25（6）：1113-1136.

[7]McFadden E S，Sear E R. The origin of Triticum spelta and its free-testing hexapoloid relatives[J]. Heredity，1946，37（4）：107-116.

[8]Feldman M. The origin of cultivated wheat[M]//Bonjean A P，Angus W J. The world wheat book：a history of wheat breeding. Paris：Lavoisier Tech.& Doc.，2001：3-56.

[9]Balint A F，Kovacs G，Sutka J. Origin and taxonomy of wheat in the light of recent research[J]. Acta. Agr. Hung.，2000，48：301-313.

[10]Feldman M，Lupton F G H，Miller T E. Wheats. Triticum spp. （Gramineae-Triticinae）[M]//Smartt J，Simmonds N W. Evolution of crop plants. 2nd edn. Longman Scientific & Technical Press，1995：184-192.endprint

[11]Gong W P，Li G R，Zhou J P，et al. Cytogenetic and molecular markers for detecting Aegilops uniaristata chromosomes in a wheat background[J]. Genome， 2014，57（9）：489-497.

[12]宮文萍，楚秀生，韓冉，等. 單芒山羊草染色體組優異基因發掘[J]. 山東農業科學， 2015，47（7）：11-15.

[13]Danilova T V，Friebe B，Gill B S. Single-copy gene fluorescence in situ hybridization and genome analysis：Acc-2 loci mark evolutionary chromosomal rearrangements in wheat[J]. Chromosoma，2012，121（6）：597-611.

[14]Tang Z X，Yang Z J，Fu S L. Oligonucleotides replacing the roles of repetitive sequences pAs1，pSc119.2，pTa-535，pTa71，CCS1，and pAWRC.1 for FISH analysis[J]. J. Appl. Genet.，2014，55（3）：313-318.

[15]任正隆，張懷瓊. 一個改良的染色體C帶技術[J]. 四川農業大學學報，1995， 13（1）：1-5.

[16]Zhang H G，Li G R，Li D H，et al. Molecular and cytogenetic characterization of new wheat-Dasypyrum breviaristatum derivatives with post-harvest re-growth habit[J]. Genes，2015，6（4）：1242-1255.

[17]Friebe B，Badaeva E D，Kammer K，et al. Standard karyotypes of Aegilops uniaristata，Ae. mutica，Ae. comosa subspecies comosa and heldreichii （Poaceae）[J]. Pl. Syst. Evol.，1996，202（3/4）：199-210.

[18]Badaeva E D，Dedkova O S，Zoshchuk S A，et al. Comparative analysis of the N-genome in diploid and polyploidy Aegilops species[J]. Chromosome Res.，2011，19（4）：541-548.

[19]劉成，宮文萍，李光蓉，等. 單芒山羊草3N染色體特異EST-STS標記[C]//2012年中國作物學會學術年會論文摘要集. 南昌：2012年中國作物學會學術年會.

[20]韓冉，隋新霞，楊洪美，等. 小麥-近緣物種染色體系的高分子量麥谷蛋白亞基組成及白粉病抗性[J]. 麥類作物學報，2015，35（11）：1494-1501.

[21]任正隆，張懷瓊. 小麥-黑麥染色體小片段易位的誘導[J]. 中國科學C輯：生命科學，1997，27（3）：259-263.

[22]Zhang J，Jiang Y， Guo Y L， et al. Identification of novel chromosomal aberrations induced by 60Co-γ-irradiation in wheat-Dasypyrum villosum lines[J]. Int. J. Mol. Sci.，2015，16（12）：29787-29796.

[23]李瑞芬，梁宏霞，趙茂林. 小麥-簇毛麥單體異附加材料外源染色體減數分裂行為的研究[J]. 中國農業科學，2002，35（2）：127-131.

[24]李瑞芬，趙茂林，張敬原. 單體異附加系花藥培養創造小麥-中間偃麥草純合易位系[J]. 西北植物學報，2006，26（1）：28-32.

[25]Liu C，Qi L，Liu W，et al. Development of a set of compensating Triticum aestivum-Dasypyrum villosum Robertsonian translocation lines[J]. Genome，2011，54（10）：836-844.

[26]Liu W X，Jin Y，Rouse M，et al. Development and characterization of wheat-Ae.sersii Robertsonian chromosome conferring resistance to stem rust[J]. Theor. Appl. Genet.，2011，122（8）：1537-1545.

[27]Zhao W C，Qi L L，Gao X，et al. Development and characterization of two new Triticum aestivum-Dasypyrum villosum Robertsonian translocation lines T1DS·1V#3L and T1DL·1V#3S and their effect on grain quality[J]. Euphytica，2010，175（3）：343-350.endprint

[28]Liu W X，Rouse M，Friebe B，et al. Discovery and molecular mapping of a new gene conferring resistance to stem rust，Sr53，derived from Aegilops geniculata and characterization of spontaneous translocation stocks with reduced alien chromatin[J]. Chromosome Res.，2011，19（5）：669-682.

[29]陳雷，李萌，王洋洋. 小麥-黑麥1BL/1RS易位系中的染色體結構變異[J]. 麥類作物學報，2015，35（8）：1038-1043.

[30]Garg M，Elamein H M，Tanaka H，et al. Preferential elimination of chromosome 1D from homoeologous group-1 alien addition lines in hexaploid wheat[J]. Genes & Genetic Systems，2007，82（5）：403-408.

[31]Tang Z，Li M，Chen L，et al. New types of wheat chromosomal structural variations in derivatives of wheat-rye hybrids[J]. PLoS ONE，2014，9 （10）：e110282.

[32]Fu S L，Yang M Y，Fei Y Y，et al. Alterations and abnormal mitosis of wheat chromosomes induced by wheat-rye monosomic addition lines[J]. PLoS ONE，2013， 8（7）：e70483.

[33]Garg M，Tanaka H，Ishikawa N. Agropyron elongatum HMW-glutenins have a potential to improve wheat end-product quality through targeted chromosome introgression[J]. Journal of Cereal Science，2009，50（3）：358-363.endprint