小麥腐霉根腐病原鑒定Ⅰ

張悅麗+張博+馬立國+李長松+田淑慧+祁凱+齊軍山

摘要：2015年冬小麥返青期，山東省青島市、臨沂市的冬小麥出現缺苗斷壟現象，葉片出現萎蔫癥狀，植株矮小，生長不良，毛細根上出現似開水燙過樣水漬狀病斑，重者小麥根系及莖基部變褐。本研究對其病原菌進行分離培養、致病性測定、形態學觀察及分子生物學鑒定。結果表明，引起兩地冬小麥根腐病（稱為腐霉根腐病）的病原菌為刺腐霉（Pythium spinosum），該病原菌菌落白色，菌絲發達，分枝繁茂。該研究結果可為冬小麥腐霉根腐病防治提供科學依據。

關鍵詞：腐霉根腐病； 刺腐霉； 冬小麥

中圖分類號：S435.121.4+7 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2017）08-0104-04

Abstract A disease was observed on winter wheat in Qingdao and Linyi regions of Shandong Province in 2015. The infected wheat showed wilt leaves， water-soaked roots and dwarf plants， and the seriously infected ones had browned roots and stem bases. Two Pythium-like strains were isolated from the infected wheat roots. Based on their morphology biological characteristics， pathogenicity and ITS sequences， the two strains were all identified as P. spinosum. The colonies were white on CMA， and mycelia developed well. The research results could provide scientific bases for prevention and control of wheat pythium root rot.

Keywords Pythium root rot； P. spinosum； Winter wheat

由腐霉菌引起的小麥根腐病（小麥腐霉根腐病）是世界性病害，現全國均有分布。小麥受到腐霉菌Pythium spp.侵染后，根系常表現為變褐腐爛，地上部分生長不良，產量降低，種子和幼苗在出土前就可霉爛和死亡。我國東北、西北春麥區發生重，黃淮海冬麥區也發生普遍。近年來，山東青島和臨沂莒南地區返青后冬小麥葉片變黃，呈點片發生，發病輕的植株根尖水漬狀，似開水燙過，地上部分生長不良。本研究通過病原菌分離、致病性測定、形態學觀察并結合腐霉菌株rDNA-ITS序列比對結果，明確引起該地區冬小麥根腐病（稱其為小麥腐霉根腐病）的病原菌，以期為該病害發生規律的探究和綜合防治措施的制定提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 病害調查與癥狀觀察

2014年2—3月在山東省青島市農業科學研究院冬小麥試驗田和莒南縣冬小麥地，對小麥腐霉根腐病的發生和危害情況進行調查，觀察記載田間病株癥狀，采集具有典型癥狀的冬小麥植株。

1.2 病原菌的分離、培養及純化

本試驗采用組織分離法從具有典型癥狀的冬小麥根部分離病菌。將病株水漬狀細毛根剪成0.5～1.0 cm小段，用自來水沖洗24 h，0.05%次氯酸鈣消毒10 min，放入WA平板28℃培養24～48 h，采用單孢分離法進行純化，轉移到CMA培養基上，將純化好的菌株SDQD-1和SDJN-1保存備用。

WA培養基：瓊脂粉18 g，用去離子水混合配制1 000 mL。

CMA培養基：玉米粉60 g，60℃水浴2 h，過濾取濾液，瓊脂粉18 g，用去離子水混合配制1 000 mL。

1.3 致病性測定

將SDQD-1和SDJN-1轉移到CMA平板上28℃暗培養7～10 d。將沙土和塑料盆用甲醛消毒。將培養好的SDQD-1和SDJN-1菌株接種到滅菌玉米粒上培養7～10 d，制成菌劑。菌劑與滅菌沙土以質量比5∶100混合均勻，裝入消毒塑料盆。取健康小麥種子（品種為濟麥22）催芽后種植在塑料盆內，每盆種植10粒，10～15℃培養。對照采用滅菌玉米粒。待小麥葉片出現萎蔫癥狀時，觀察小麥植株發病情況，并將根取出，觀察并記錄根發病情況。取有水漬癥狀的根，分離致病菌，觀察與接種菌是否一致。

1.4 病原菌形態觀察

將腐霉菌株在CMA培養基上培養7 d，觀察菌落形態特征。將SDQD-1和SDJN-1在WA平板上暗培養2 d后移取邊緣菌絲至皮氏（Petris）培養液中，28℃培養2～5 d挑取孢子囊，觀察孢子囊形態，測量孢子囊大小。待出現藏卵器、雄器、卵孢子后，觀察并記錄藏卵器及雄器的形態和著生位置、配合情況及卵孢子的形態特征。每項指標分別觀察測量50個。

1.5 病原菌分子生物學鑒定

1.5.1 病原菌DNA提取 將供試菌株接種到CMA培養基上，25℃培養5 d，收集菌絲。采用CTAB法提取和純化基因組DNA，并置于-20℃冰箱中備用。

1.5.2 ITS基因擴增 PCR反應在ABI 2720 PCR儀上進行。使用50 μL PCR反應體系：緩沖液[KCl 20 mmol， （NH4）2SO4 10 mmol， MgCl2 2 mmol， Tris-HCl 20 mmol， pH 8.4]、dNTPs各200 μmol，真菌rDNA-ITS通用引物ITS1/ITS4各15 pmol，Taq DNA聚合酶（Biocolor BioScience and Technology，Shanghai， China） 2.5 units，模板DNA 100 ng。PCR反應條件：95℃預變性3 min；94℃變性40 s，54℃退火50 s，72℃延伸60 s，共35個循環；72℃延伸10 min。經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。每次反應設不含模板DNA為陰性對照。endprint

1.5.3 PCR擴增產物測序和序列分析 將PCR擴增產物經DNA純化試劑盒純化回收后，送上海生工進行測序。將測序結果在GenBank上與已發表的基因進行同源性比對。

1.5.4 數據分析 運用Mega 5.2.2軟件，采用鄰接法（neighbor joininig，NJ）對基因序列進行系統分析。

2 結果與分析

2.1 小麥腐霉根腐病的癥狀特點及致病性測定結果

腐霉菌株能侵染冬小麥種子，出土前就能引起冬小麥種子腐爛，降低出苗率。致病性測定結果表明苗期小麥受到侵染后，根系短小，次生根減少，地上部分矮化，鮮重減輕，能引起第一片葉卷曲，使葉片不能正常伸展（圖1）。

2.2 形態特征觀察

SDQD-1和SDJN-1菌落在CMA上呈放射狀，白色，菌絲發達，無隔，孢子囊球形、近球形，直徑9.0～22.0（平均14.5）μm，偶有1～2個乳狀突起物，頂生、間生或切生。藏卵器球形、近球形，直徑13.3～22.3（平均 18.4）μm，頂生為主，多數壁上均勻密布指狀突起物，少數壁上的突起物稀疏，突起物有時稍彎曲，頂端圓鈍，高1.4～6.7（平均 4.0）μm，偶爾光滑。雄器多同絲生，雄器細胞棍棒形、彎棍棒形、彎弓形，每個藏卵器與1個（偶爾2～3個）雄器結合，雄器細胞完成受精作用后常消解。卵孢子球形，直徑12.8～19.5（平均 16.5）μm，滿器，偶爾不滿器，每個藏卵器有1個卵孢子。菌株SDQD-1和菌株SDJN-1的形態特征相同，基本符合《中國真菌志》第六卷霜霉目（余永年，1998）中刺腐霉（Pythium spinosum）的特征描述[1]。

2.3 序列分析

經ITS1和ITS4引物對擴增rDNA-ITS序列，從SDQD-1和SDJN-1菌株基因組中擴增均獲得924 bp的序列，兩者相似性為100%。將SDQD-1序列在GenBank中進行序列一致性比較，結果表明與P. spinosum（GenBank號：HQ643791.1）的ITS序列同源性達99%。

利用Mega5.2.2軟件對不同菌株放rDNA-ITS序列進行進聚類分析，結果表明供試菌株SDQD-1與P. spinosum（GenBank號：HQ643791）為同一分支，進化距離最近（圖2）。根據病原菌的形態特征及ITS序列同源性比較結果，鑒定SDQD-1和SDJN-1為刺腐霉（P. spinosum）。

3 討論與結論

Vanterpool最早于19世紀30年代在加拿大發現Pythium arrhenomanes 等常可導致大麥、冬小麥和其他糧食作物的根腐病，此后，許多國家的學者們也相繼報道該病害，并對麥作土壤中腐霉，特別是致病腐霉及其引起的病害有廣泛的研究，美國和澳大利亞報道比較多，日本也做了不少研究，而國內已報道引起小麥根腐病的病原菌有麥根腐平臍蠕孢Bipolaris sorokiniana、尖孢鐮孢菌Fusarium oxysporum、層出鐮孢菌Fusarium proliferatum、黃色鐮孢菌Fusarium culmorum等[2]，由腐霉菌引起的小麥根腐病研究的較少。1989—1990年，王政逸等從浙江省各冬小麥產區的病株和麥田土壤中分離鑒定了5個腐霉種，并對其做了致病性研究[3]。余永年等[4]對我國不同植被土壤中腐霉菌種類及其數量分布做了大量研究，認為大田土（包括麥類土等）中腐霉數量僅次于菜田土，并從中分離到了15種腐霉菌；在禾谷類區系中，以瓜果腐霉（P. aphanidermatum）、強雄腐霉（P. arrhenomanes）、禾生腐霉（P. graminicola）和終極腐霉（P. ultimum）較為豐富。經分離和致病性檢測，浙江省引起大、小麥根腐病的腐霉菌包括P. dissotocum、 P. irregulare、P. polypapillatum、P. spinosum和P. ultimum 5種，均能引起供試大、小麥的根腐、根褐變和壞死，第一片葉卷曲，植株矮小的癥狀[5]，與本試驗致病性測定時癥狀相似。

本研究從山東青島和莒南縣冬小麥區感病小麥的植株根部分離的病原菌均能致病，經形態和分子鑒定為同一個種，即刺腐霉（P. spinosum）。有關該病害的發生流行規律、侵染循環及防治措施等還需進一步研究。

參考文獻：

[1]余永年. 中國真菌志（第六卷.霜霉目）[M]. 北京： 科學出版社， 1998.

[2]張德珍， 李鵬昌， 陳曉霞，等. 山東省小麥根腐病病原菌的分離鑒定[J]. 植物保護學報， 2016， 43（2）： 233-240.

[3]王政逸， 張炳欣， 樓兵干. 浙江省小麥根圍土壤腐霉（Pythium spp.）的一些生態學研究[J]. 植物病理學報， 1996， 26（1）： 29-35.

[4]余永年， 馬國忠， 劉曉娟. 腐霉屬分類性狀評價及其中國的種[J]. 真菌學報， 1990， 9（4）： 249-262.

[5]沈杰， 張炳欣. 浙江省大、小麥致病腐霉的研究[J]. 植物病理學報， 1994， 24（2）： 107-112.endprint