老年直腸癌患者外周血與癌組織miR-141的表達及其臨床相關性

馮 莉，呂雅蕾，常 靚，劉 妍，王 龍，徐志宏，王貴英

(河北醫科大學第四醫院：1.腫瘤內科，2.外二科，石家莊 050011)

論著·臨床研究

老年直腸癌患者外周血與癌組織miR-141的表達及其臨床相關性

馮 莉1，呂雅蕾1，常 靚1，劉 妍1，王 龍1，徐志宏1，王貴英2△

(河北醫科大學第四醫院：1.腫瘤內科，2.外二科，石家莊 050011)

目的 研究老年直腸癌患者外周血與癌組織微小RNA(miR)-141的表達及臨床相關性。方法 75例直腸癌患者取直腸癌組織及癌旁正常組織并抽取肘靜脈血，應用實時聚合酶聯法檢測直腸癌、癌旁正常組織標本和外周血中miR-141的表達水平，分析直腸癌組織和外周血miR-141的相關性，外周血miR-141與臨床病理特征和臨床預后的關系。結果 (1)與健康體檢者外周血或者與正常癌旁組織相比，miR-141的表達水平在直腸癌患者外周血和直腸癌組織中均明顯下調(P<0.01)；(2)有淋巴結轉移的患者中直腸癌組織miR-141水平與外周血miR-141水平呈正相關(r=0.694，P<0.01)，無淋巴結轉移的患者中直腸癌組織miR-141水平與外周血miR-141水平呈正相關(r=0.725，P<0.01)；(3)直腸癌患者外周血miR-141表達與腫瘤分期、腫瘤分化程度和有無淋巴結轉移相關；(4)術后6個月隨訪顯示，75例患者中有13例(17.33%)患者出現復發/轉移，復發/轉移患者外周血miR-141水平為(2.64±0.34)，顯著低于未復發/轉移患者(P<0.01)。結論 miR-141在直腸癌患者外周血中表達與在癌組織中表達變化趨勢一致，可反映直腸癌的臨床病理特征。

直腸腫瘤；老年人；微RNAs;預后；miRNA-141

直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，目前隨著社會發展和人民生活水平的提高，其發病率也呈上升趨勢，居消化道腫瘤第2位[1]，并且以4.2%的平均速度逐年遞增[2-3]。結直腸癌的早期篩查與診斷越來越受到人們的關注。近年來新發現的微小RNA(microRNA，miR) 是一類非編碼小RNA分子，由20～24個核苷酸組成。miR可抑制miR的翻譯，并誘導miR的切割降解[4]。近年來大量研究證實，miR可發揮抑癌基因或癌基因的作用，通過負調控基因表達，參與惡性腫瘤的發生、發展過程，miR有望成為腫瘤的早期診斷、特異性治療及評估預后的標志物。目前對miR在腫瘤患者中表達的研究主要集中于腫瘤組織樣品中，而以血清作為樣品的研究較少。已有研究顯示，miR-21在結直腸癌、食管鱗狀細胞癌等患者血清中表達上調，提示其有望應用于多種惡性腫瘤的早期診斷和預后評估[5-6]。有報道發現，miR-141在結直腸癌患者血清中的表達水平顯著高于健康人，結腸癌血清miR-141水平與臨床分級和預后密切相關[7]。由于miR-141在不同腫瘤中作用不同，如在頭頸部鱗狀細胞癌、非小細胞肺癌、女性生殖系統腫瘤和腎細胞癌中具有抑制腫瘤遷移、侵襲、增殖和耐藥的作用[8-10]，但在卵巢癌中miR-141會促進腫瘤細胞增殖和耐藥性[11-12]。本研究探討直腸癌組織與血清miR-141的相關性，分析其與直腸癌的發展和預后的相互關系，為結直腸癌預后的推測及治療尋求一種簡便、可靠的檢測方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究的直腸癌患者為 2014年1～12月在本院收治的患者，最后共納入75例。患者的納入標準：(1)年齡大于或等于60歲；(2)經過組織病理學確診為直腸癌；(3)為避免治療的影響，所有納入對象均未經過放療或化療。對象納入的直腸癌患者中男43例(57.33%)，女32例(42.67%)；年齡60～72歲，平均(65.26±6.52)歲；腫瘤直徑2.4～7.3 cm，平均(4.63±1.58)cm；腫瘤TNM分期Ⅰ期13例(17.33%)、Ⅱ期31例(41.33%)、Ⅲ期24例(32.00%)、Ⅳ期7例(9.34%)；黏膜下層浸潤46例(61.33%)、黏膜層浸潤29例(38.67%)；距肛緣距離大于或等于5 cm 40例(53.33%)，距肛緣距離小于5 cm 35例(46.67%)；高度分化16例(21.33%)、中度分化23例(30.67%)和低度分化36例(48.00%)；無淋巴結轉移31例(41.33%)、有淋巴結轉移44例(58.67%)。同時按照年齡和性別配比選取同期在本院體檢中心健康體檢者40例作為對照，年齡60～75歲，平均(66.45±5.96)歲；男22例(55.00%)、女18例(45.00%)。兩組受試者年齡和性別差異均無統計學意義(P>0.05)。所有對象均簽署知情同意書，研究經本院倫理委員會審核通過。

1.2 主要試劑 mirVanaTMPARISTMmiRNA試劑盒，由美國Applied Biosystems提供；FAST1000試劑盒，由北京先鋒生物公司提供；Affymetrix 逆轉錄試劑盒，由美國Qiagen 公司提供；Micrornas實時聚合酶聯反應(real time-polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測試劑盒，由北京艾德萊生物科技公司；miR-141及內參U6引物設計與合成由北京艾德萊生物科技公司提供，miR-141的引物序列為5′-CCG GTA ACA CTG TCT GGT AA-3′，內參U6的引物序列為5′-GCT TCG GCA GCA CAT ATA CTA AAA T-3′。

1.3 主要儀器 紫外可見分光光度儀，由德國Eppendorf公司提供；ABI step one熒光定量PCR儀，由美國ABI公司提供；GeneGenius全自動凝膠成像系統，由美國Syngene公司提供。

1.4 試驗方法 提取受試者外周血和直腸標本的RNA，采用Real-time PCR法測定直腸病理組織。

1.4.1 RNA提取 抽取受試者空腹肘靜脈血5 mL，室溫下靜置30 min，待血液完全凝固后離心分離血清。取血清采用mirVanaTMPARISTMmiRNA試劑盒提取總RNA。直腸組織RNA提取采用FAST1000試劑盒進行。稱取100 mg直腸癌組織或癌旁正常組織并加入裂解液，研磨，吸取裂解液后加入氯仿進行混勻，離心，加入聚合液并轉移至內套管，洗脫液洗脫2次，高速離心，將內套管移入EP內，膜中央加洗脫液RNase-free H2O，靜置，離心，即得。所得RNA 經紫外分光光度法測定濃度，吸光度A260/A280為1.8～2.1的RNA樣品于-80 ℃保存。

1.4.2 RT-PCR 采用Affymetrix one-cycle cDNA Synthesis Kit，以總RNA為模板，miR-141 特異性逆轉錄引物進行逆轉錄反應得cDNA。逆轉錄條件如下：16 ℃ 30 min；42 ℃ 30 min；85 ℃ 5 min。將逆轉錄所得cDNA純化后應用Micrornas RT-PCR檢測試劑盒在ABI step one熒光定量PCR儀進行PCR擴增。反應總體積為20 μL：1.5 μL cDNA 模板，1 μL miR-141或U6引物，10 μL miRNA qPCR Mix，7.5 μL H2O。PCR反應條件為:94 ℃預變性3 min，然后以94 ℃ 20 s、60 ℃ 20 s和72 ℃ 40 s，循環40次。以U6 為參照，采用2-△△Ct計算目標基因的相對表達量。

1.5 臨床治療和療效評價 所有Ⅰ期患者根治術后觀察隨訪，Ⅱ～Ⅲ期患者根治術后接受輔助放化療，Ⅳ期患者姑息術后接受一線化療。化療方案均采用mFOLFOX6方案(奧沙利鉑85 mg/m2，靜脈滴注大于2 h，第1天；四氫葉酸鈣400 mg/m2，靜脈滴注2 h，第1天；氟尿嘧啶0.4 g/m2，靜脈推注，2.4 g/m2，持續靜脈輸注46～48 h；每2周為1個周期)或XELOX方案(奧沙利鉑130 mg/m2，靜脈滴注大于2 h，第1天；卡培他濱 850～1000 mg/m2，每天兩次口服，第1～14天；每3周為1個周期)。術后輔助放療于術后2個月內在本院放療科實施。術后6個月觀察腫瘤復發/轉移情況。

2 結 果

2.1 組織及外周血miR-141的表達 直腸癌患者直腸癌組織miR-141表達水平(5.13±0.62)較癌旁正常組織(8.67±0.95)明顯下調(t=27.025，P<0.01)；直腸癌患者外周血miR-141水平(3.54±0.44)較健康體檢者(6.24±0.76)明顯下調(t=20.409，P<0.01)。見圖1、2。

A、B、C：直腸癌組織，D、E、F：癌旁正常組織。

圖1 直腸癌組織和癌旁正常組織miR-141的表達

A、B、C：直腸癌患者，D、E、F：正常體檢者。

圖2 直腸癌患者和健康體檢者外周血miR-141的表達

2.2 直腸癌組織與外周血miR-141水平的相關性分析 有淋巴結轉移的患者中直腸癌組織miR-141水平與外周血miR-141水平呈正相關(r=0.694，P<0.01)，無淋巴結轉移的患者中直腸癌組織miR-141水平與外周血miR-141水平亦呈正相關(r=0.725，P<0.01)。

2.3 外周血miR-141表達與直腸癌臨床病理特征的單因素分析 對外周血miR-141的表達水平與直腸癌臨床病理特征進行單因素分析后，發現miR-141表達水平與研究對象的年齡、性別、腫瘤直徑、浸潤程度、距肛緣距離不存在明顯的關聯(P>0.05)，但是隨著患者腫瘤分期的增大血液miR-141表達下調(P<0.01)，隨著患者腫瘤分化程度降低而血液miR-141表達下調(P<0.01)，有淋巴結轉移的患者較無淋巴結轉移的患者其血液miR-141表達下調(P<0.01)。見表1。

2.4 外周血miR-141水平與臨床療效的相關性分析 術后6個月隨訪時共有13例(17.33%)患者出現腫瘤復發/轉移。出現腫瘤復發/轉移的患者和未出現腫瘤復發/轉移的患者其術前外周血miR-141水平分別為(2.64±0.34)和(5.65±0.56)，差異有統計學意義(t=18.613，P<0.01)。

表1 外周血miR-141表達與直腸癌臨床病理特征的關系

3 討 論

近年來由于生活方式加快、飲食習慣等改變，直腸癌發病率、病死率呈不斷上升趨勢[13]。伴隨老齡化現象，直腸癌老年患者的數量增長更為顯著[14]。miRs 是一類內生、小分子非編碼的調控RNAs，由20～24 個核苷酸短序列組成，3′端有1～2個堿基長度變化。在人類基因組中約有900多種特定的miR，其中1/3由miRs調控[15]。miRs 在機體各種生理及病理過程中發揮重要作用，并且有可能成為腫瘤的早期診斷、特異性治療及評估預后的標志物。miRs在腫瘤中具有特定的表達模式，在腫瘤患者的循環核酸中存在源自腫瘤的miRs 分子，并且較高的穩定性和特異性，因此血清miRs有望成為腫瘤無創診斷的新型分子標志物。由于外周血樣品檢測具有非創傷性、可重復測試、多指標及同時檢測等優點，適合于所有癌癥患者尤其適用于年老體弱患者的隨訪，故血清miRs的檢測更適于臨床應用。miR-200家族是近年來研究比較集中的熱點，miR-141作為miR-200家族成員，具有上皮組織細胞特異性的miRs，在維持上皮細胞表型穩定方面發揮重要作用，但當其表達失調時可促進細胞表型上皮-間質轉換并導致上皮來源腫瘤的增殖、侵襲、轉移。眾多研究顯示，miR-141 與結直腸癌、子宮癌、前列腺癌、肝細胞肝癌、腎透明細胞癌及子宮內膜癌等惡性腫瘤的發生和發展密切相關，與膽管癌細胞的增殖和腎透明細胞癌的侵襲活動有關，提示miR-141與多種腫瘤的發病機制及轉移等有關[16-19]。

血清miRs在診斷方面的作用是近年來研究的熱點。血清miRs 表達穩定、取材方便、損傷性小，并且可以耐受RNase 消化、反復凍融、強酸強堿、高溫煮沸等條件而不被破壞[20]，提示循環miR可以作為一種無創性生物標志物，用于診斷、預后等判斷[21]。本研究結果顯示，直腸癌組織miR-141表達水平較癌旁正常組織明顯下調(P<0.01)，并且外周血miR-141水平較健康體檢者明顯下調(P<0.01)，提示在直腸癌的發生、發展中miR-141可能作為抑癌基因發揮重要作用，這點與其在結腸癌發生和發展中的作用不同。有淋巴結轉移的患者中直腸癌組織miR-141水平與外周血miR-141水平呈正相關(r=0.694，P<0.01)，無淋巴結轉移的患者中直腸癌組織miR-141水平與外周血miR-141水平亦呈正相關(r=0.725，P<0.01)。因此，無論直腸癌患者是否發生淋巴結轉移，癌組織miR-141水平與外周血miR-141水平均呈正相關。分析外周血miR-141與直腸癌臨床病理參數相關性結果顯示，血液miR-141表達與年齡、性別、腫瘤直徑、浸潤程度、距肛緣距離無明顯相關性(P>0.05)，提示患者的年齡、性別并不影響外周血miR-141的表達，同時miR-141的表達水平也不能指示腫瘤大小、浸潤程度或者直腸癌的位置。患者腫瘤分期越晚及腫瘤分化程度越低血液miR-141表達下調(P<0.01)，并且有淋巴結轉移的患者較無淋巴結轉移的患者血液miR-141表達下調(P<0.01)，提示血液miR-141與直腸癌分化、轉移相關，而腫瘤的分化、轉移等與患者預后有直接相關性。已有研究表明，血漿miR-141水平是檢測Ⅳ期結腸癌的敏感標志，并且血漿中miR-141水平與患者短期生存情況密切相關，推測其可獨立作為結腸癌預后的指標[22]。另有研究顯示，結腸癌組織中miR-141的表達量和癌旁正常組織顯著不同，并且結腸癌組織的分化程度不同則miR-141的表達不同，并且結腸癌轉移患者和非轉移患者結腸癌組織中miR-141的表達量不同，提示miR-141的表達可能與結腸癌的分化程度和淋巴結有無轉移相關[23]。在本研究中，術后6個月出現腫瘤復發/轉移的直腸癌患者和未出現腫瘤復發/轉移的患者其術前外周血miR-141水平分別為(2.64±0.34)和(5.65±0.56)，差異有統計學意義(t=18.613，P<0.01)，說明外周血miR-141水平與直腸癌患者的臨床預后密切相關。雖然對于血清中miR-141的來源尚不確定，目前有觀點認為其來自于凋亡或壞死的細胞，細胞的主動釋放，以及循環細胞的裂解，但是由于考慮其具有穩定、取材方便、損傷性小的優點，并且與腫瘤組織中miR-141表達水平呈正相關，并且與患者臨床預后密切相關，因此可考慮作為直腸癌患者臨床預后的判斷指標。

總之，miR-141在直腸癌患者外周血中的表達與在癌組織中表達變化趨勢一致，可反映直腸癌的病理特征，可考慮作為直腸癌臨床預后的備選生物學標記物。

[1]文莎麗，張靜平.直腸癌結腸造口患者家屬焦慮、抑郁狀況及其影響因素研究[J].中國全科醫學，2013，16(7A)：2291-2293.

[2]Agüero F，Murta-Nascimento C，Gallén M，et al.Colorectal cancer survival：results from a hospital-based cancer registry[J].Rev Esp Enferm Dig，2012，104(11)：572-577.

[3]Arredondo J，Baixauli J，Beorlegui C，et al．Prognosis factors for recurrence in patients with locally advanced rectal cancer preoperatively treated with chemoradiotherapy and adjuvant chemotherapy[J].Dis Colon Rectum，2013，56(4):416-421.

[4]Lam TK，Shao S，Zhao Y，et al.Influence of quercetinrich The food intake on mirna expression in lung cancer tissues [J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2012，21(12)：2176 -2184.

[5]Toiyama Y,Takahashi M,Hur K,et al.Serum miR-21 as a diagnostic and prognostic biomarker in colorectal cancer[J].J Natl Cancer Inst,2013,105(12):849-859.

[6]Kurashige J,Kamohara H,Watanabe M,et al.Serum microRNA-21 is a novel biomarker in patients with esophageal squamous cell carcinoma[J].J Surg Oncol,2012,106(2):188-192.

[7]馬一楠，金迎迎，王亞利，等.miR-141表達抑制增強結腸癌細胞對5-Fu藥物敏感性的研究[J].山西醫科大學學報，2016，47(6)：510-517.

[8]Chen X，Wang X，Ruan A，et al.miR-141 is a key regulator of renal cell carcinoma proliferation and metastasis by controlling EphA2 expression[J].Clin Cancer Res，2014，20(10)：2617-2630.

[9]Marchini S，Cavalieri D，Fruscio R，et al.Association between miR-200c and the survival of patients withstage Ⅰ epithelial ovarian cancer:a retrospective study of two independent tumour tissue collections[J].Lancet Oncol，2011，12(3)：273-285.

[10]Ceppi P，Mudduluru G，Kumarswamy R，et al.Loss of miR-200c expression induces an aggressive，invasive，and chemoresistant phenotype in non-small cell lung cancer[J].Mol Cancer Res，2010，8(9)：1207-1216.

[11]van Jaarsveld MT，Helleman J，Boersma AW，et al.miR-141 regulates KEAP1 and modulates cisplatin sensitivity in ovarian cancer cells[J].Oncogene,2013,32(36)：4284-4293.

[12]Hur K，Toiyama Y，Takahashi M，et al.MicroRNA-200c modulates epithelial-to-mesenchymal transition(EMT) in human colorectal cancer metastasis[J].Gut，2013，62(9)：1315-1326.

[13]Taylor FG，Quirke P，Heald RJ，et al.Preoperative high- resolution magnetic resonance imaging can identify good prognosis stage Ⅰ，Ⅱ，and Ⅲ rectal cancer best managed by surgery alone:a prospective，multicenter，European study[J].Ann Surg，2011，253(4)：711-719.

[14]Ozden SA，Ozyurt H，Ozgen Z，et al.Prognostic role of sensitive-to-apoptosis gene expression in rectal cancer[J].World J Gastroenterol，2011，17(44)：4905-4910.

[15]Kim VH，Han J，Siomi MC.The Biogenesis of small RNAs in animals[J].Nat Rev Mol Cell Biol，2009，10(2)：126-139.

[16]Gonzales JC，Fink LM，Goodman Jr OB，et al.Comparison of circulating microRNA 141 to circulating tumor cells，lactate dehydrogenase，and prostate-specific antigen for determining treatment.The response in patients with metastatic prostate cancer [J].J Clin Genitourin Cancer，2011，9(1)：39-45.

[17]Lee TS，Jeon HW，Kim YB，et al.The Aberrant mirna expression in Endometrial carcinoma using formalin - fixed paraffin - embedded(FFPE) tissues [J].PLoS One，2013，8(12)：e81421.

[18]Liu Y，Ding Y，Huang J，et al.MiR-141 suppresses the migration and night of HCC cells by targeting Tiam1 [J].PLoS One，2014，9(2)：e88393.

[19]Yu XY，Zhang Z，Liu J，et al.MicroRNA- 141 is downregulated in human renal cell carcinoma and regulates cell survival by targeting CDC25B [J].Onco Targets Ther，2013，10(6)：349-354.

[20]Davalos V，Moutinho C，Villanueva A，et al.Dynamic epigenetic regulation of the microRNA - 200 family mediates epithelial and mesenchymal transitions in human tumorigenesis[J].Oncogene，2012，31(16)：2062-2074.

[21]Vrba L，Jensen TJ，Garbe JC，et al.Role for DNA methylation in the regulation of miR -200c and miR -141 expression in normal and cancer cell[J].PLoS One，2010，5(1)：e8697.

[22]Cheng H，Zhang L，Cogdell DE，et al.The Circulating plasma MiR-141 is will be a biomarker for metastatic colon cancer and predicts poorprognosis[J].PLoS One，2011，6(3)：e17745.

[23]王亞南，陳昭華，陳衛昌，等.microRNA-141在結腸癌中的表達分析研究[J].重慶醫學，2015，44(16)：2250-2252.

Expression and clinical correlation of miR-141 in peripheral blood and tumor tissue in elderly patients with rectal cancer*

FengLi1,LvYalei1,ChangLiang1,LiuYan1,WangLong1,XuZhihong1,WangGuiying2△

(1.DepartmentofOncology;2.SecondDepartmentofSurgery,FourthHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang,Hebei050011,China)

Objective To study the expression and clinical correlation of miR-141 in peripheral blood and tumor tissue in elderly patients with rectal cancer.Methods Rectal tumor tissue and tumor-adjacent normal tissues were taken in 75 cases of rectal cancer.The expression levels of miR-141 in peripheral blood and tumor tissue as well as tumor-adjacent normal tissues were determined by real-time polymerase chain reaction method.The correlation of miR-141 expression between peripheral blood and tumor tissue,and the correlation of peripheral blood miR-141 with clinicopathologic features and clinical prognosis were analyzed.Results (1) Compared with peripheral blood in the subjects undergoing normal physical examination or tumor-adjacent normal tissue in the patients with rectal cancer,the miR-141 expression level in peripheral blood and tumor tissue in the patients with rectal cancer was decreased significantly (P<0.01).(2) The cancer tissue miR-141 level in the patients with lymph node metastasis was positively correlated with peripheral blood miR-141 level (r=0.694，P<0.01),and cancer tissue miR-141 level in the patients without lymph node metastasis was positively correlated with peripheral blood miR-141 level (r=0.725，P<0.01).(3) The differences between peripheral blood miR-141 level with tumor stage,tumor differentiation degree and lymphatic metastasis had statistical significance (P<0.01).(4)The postoperative 6-month follow up displayed that among 75 cases,13 cases(17.33%) appeared replase/ metastasis,and peripheral blood miR-141 level was (2.64±0.34),which was significantly lower than that in the patents without replase/metastasis (P<0.01).Conclusion Expression variation trend of miR-141 in peripheral blood is similar to that in tumor tissue,which can reflect the clinicopathologic feature in the patients with rectal patients.

rectal neoplasms;aged;microRNAs;prognosis;miRNA-14

河北省衛生廳醫學科學研究重點課題(20150769)。

馮莉(1982-)，主治醫師，博士，主要從事消化道惡性腫瘤的臨床與基礎研究。

△通信作者，E-mail:wgy777@yeah.net。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.24.008

R735.2

A

1671-8348(2017)24-3339-04

2016-12-22

2017-03-10)