miRNA表達譜在缺氧缺血性腦病新生兒血漿中的變化及意義

張旭 朱雯 何夢藻 侯秋英 沈方方 張佩華 滕懿群

miRNA表達譜在缺氧缺血性腦病新生兒血漿中的變化及意義

張旭 朱雯 何夢藻 侯秋英 沈方方 張佩華 滕懿群

目的 篩選新生兒缺氧缺血性腦病（HIE）相關的m iRNA，探討m iRNA在HIE診斷、治療和預后中的指導意義。方法 選擇HIE新生兒117例，根據病情分為輕度組69例和中重度組48例；選擇同期分娩的健康足月新生兒30例為健康對照組。利用m iRNA芯片檢測3組新生兒血漿m iRNA表達譜的差異，從中挑選6個m iRNA進行Real-time PCR驗證，比較各組血漿m iRNA表達并分析與HIE診斷、治療和預后的關系。 結果 m iRNA芯片檢測HIE組共有55種m iRNA表達有明顯差異，有29種m iRNA表達上調，26種表達下調。與健康對照組比較，HIE組血漿中m iR-4472、m iR-5195-3p、m iR-6794-5p表達明顯上調，let-7b-5p表達明顯下調，差異均有統計學意義（均P＜0.01）。HIE中重度組m iR-4472、m iR-5195-3p、m iR-6794-5p表達顯著高于輕度組，而let-7b-5p表達顯著低于輕度組，差異均有統計學意義（均P＜0.01）。與治療前比較，治療后HIE輕度組和中重度組m iR-4472、m iR-5195-3p、m iR-6794-5p表達量下降，let-7b-5p表達量上升，差異均有統計學意義（均P＜0.01）。ROC曲線分析顯示m iR-4472、m iR-5195-3p、m iR-6794-5p和let-7b-5p 4種m iRNA的AUC分別為0.958、0.938、0.986和0.969。m iR-4472、m iR-6794-5p高表達組后遺癥發生率明顯高于低表達組（均P＜0.05），而m iR-5195-3p、let-7b-5p與HIE預后無相關性（均P＞0.05）。 結論 HIE患兒血漿中m iR-4472、m iR-5195-3p、m iR-6794-5p表達水平顯著升高，而let-7b-5p表達水平顯著下降，其中m iR-4472、m iR-6794-5p可能是預測HIE預后的生物標志物。

缺氧缺血性腦病 新生兒 m iRNA

新生兒缺氧缺血性腦病（hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE）是圍生期各種原因導致的缺氧缺血性腦損傷，病死率高，預后差，可造成腦癱、智力低下及癲癇等嚴重神經后遺癥[1]。miRNA是一種內源性的含有19～22個核苷酸的非蛋白編碼單鏈RNA，可通過抑制目標mRNAs翻譯或促進降解的方式介導轉錄后基因沉默，是細胞生長、分化及腫瘤形成的關鍵調控因子[2]。相關研究已證實miRNA在腦梗死、癲癇等患者的中樞神經系統中表達異常[3-6]，然而miRNA在HIE誘導的腦損傷中的機制仍不完全清楚。本研究應用miRNA芯片篩選HIE新生兒血漿miRNA表達譜，通過Real-time PCR對篩選出的miRNA進行驗證，探討血漿miRNA在HIE的診斷、嚴重程度和預后評估等方面的應用價值。

1 對象和方法

1.1 對象 選擇2013年7月至2016年4月在嘉興市第二醫院新生兒科住院治療的HIE新生兒117例（HIE組），男76例，女41例；胎齡35～42（39.41±1.30）周；出生體重2 200～4 300（3 277.81±496.30）g。選擇同期分娩的健康足月新生兒30例為健康對照組，男18例，女12例；胎齡37～41（39.61±0.94）周；出生體重2 600～4 100（3 430.83±448.43）g；均無宮內發育遲緩、窒息及神經系統疾病等病史，母親孕期健康、分娩過程中無異常。兩組新生兒胎齡、出生體重比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。根據中華醫學會兒科分會新生兒學組制定的新生兒HIE診斷標準[7]，將HIE組分為輕度組69例，中重度組48例。輕度組予以吸氧、鎮靜、止痙、降顱內壓、糾正酸中毒等常規治療，中重度組在常規治療基礎上聯合亞低溫治療。所有HIE患兒隨訪1年，隨訪中診斷腦癱、癲癇、智力低下及共濟失調等認為有后遺癥。本研究經醫院倫理委員批準和患兒家屬知情同意。

1.2 主要試劑和儀器 miRNA基因表達譜芯片及雜交試劑（美國LC Sciences公司）；miRNA提取試劑盒（Exosome Kit，美國Norgen公司）；總RNA提取試劑盒（上海捷瑞公司）；熒光定量PCR試劑盒（北京天根公司）；GenePix 4000B激光掃描儀（美國Molecular Device公司）；CFX Connect Real-Time System PCR儀（美國Bio-Rad公司）。

1.3 方法

1.3.1 血標本的采集與miRNA提取 EDTA抗凝管采集新生兒出生后24h及治療后2周靜脈血3ml，3 000r/min離心10min，取500μl血漿。應用miRNA提取試劑盒提取總miRNA，并測定RNA純度及質量。

1.3.2 miRNA表達譜芯片檢測 取4～8μg總RNA樣品并進行熒光標記，與μParafloTM微流體芯片進行雜交檢測miRNA表達譜。采用GenePix 4000B激光掃描儀獲取雜交圖像，Array-Pro圖像分析軟件進行圖像數字化轉換及分析。

1.3.3 Real-time PCR檢測芯片篩選表達差異的miRNA 按總RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，反轉錄合成cDNA，用CFX Connect Real-Time System PCR儀進行擴增，以U6為內參照，用2－△△ct表示miRNA相對表達量。

1.4 統計學處理 采用SPSS 19.0統計軟件。計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；計數資料以頻數及率表示，組間比較采用χ2檢驗。繪制ROC曲線，計算AUC，AUC＞0.9表示診斷性較高。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HIE患兒血漿miRNA表達譜變化 miRNA芯片共檢測921種miRNA。與健康對照組相比，HIE組血漿中有55種表達差異的miRNA，其中29種表達上調，26種表達下調，見表1。

2.2 各組miRNA表達水平的比較 根據芯片顯示miRNA表達差異顯著程度，結合相關文獻報道[8-10]，選擇6種miRNA（miR-4472、miR-5195-3p、miR-6752-5p、miR-6794-5p、miR-139-5p、let-7b-5p）進行Real-time PCR驗證，結果顯示血漿中的miR-4472、miR-5195-3p、miR-6794-5p和let-7b-5p表達水平和芯片結果保持一致。與健康對照組比較，HIE組血漿中miR-4472、miR-5195-3p、miR-6794-5p表達明顯上調（t=13.517、16.145、17.277，均P＜0.01），let-7b-5p表達明顯下調（t=-13.761，P＜0.01）；進一步比較輕度組和中重度組之間的差異，發現中重度組miR-4472、miR-5195-3p、miR-6794-5p表達顯著高于輕度組（t=11.845、11.977、15.999，均P＜0.01），而let-7b-5p表達顯著低于輕度組（t=-17.236，P＜0.01）；與治療前比較，治療后輕度組和中重度組miR-4472（t=-5.569、-5.900，均P＜0.01）、miR-5195-3p（t=-4.653、-5.554，均 P＜0.01）、miR-6794-5p（t=-5.144、-6.274，均P＜0.01）表達量均下降，let-7b-5p表達量均上升（t=7.755、8.845，均P＜0.01），見表2。

表1 H I E患兒血漿m i RN A表達譜變化

表2 各組m i RN A的表達水平比較

2.3 血漿miRNA診斷HIE的價值 根據HIE組和健康對照組miR-4472、miR-5195-3p、miR-6794-5p和let-7b-5p的差異表達，繪制ROC曲線，AUC均＞0.9，分別為 0.958（95%CI：0.929～0.998）、0.938（95%CI：0.901～0.974）、0.986（95%CI：0.970～1.00）和0.969（95% CI：0.944～0.995），見圖1。

圖1 4種m i RN A診斷患兒H I E的R O C曲線

2.4 HIE患兒血漿miRNA的表達與預后的關系 根據中重度HIE患兒血漿miRNA Real-time PCR檢測結果，分別將miR-4472、miR-5195-3p、miR-6794-5p和 let-7b-5p分為高表達組及低表達組，結果發現miR-4472、miR-6794-5p高表達組后遺癥發生率明顯高于低表達組（均P＜0.05），說明miR-4472、miR-6794-5p與HIE預后顯著相關，而miR-5195-3p、let-7b-5p與HIE預后均無相關性（均P＞0.05），見表3。

表3 中重度H I E患兒m i RN A表達水平與預后的關系[例（%）]

3 討論

HIE是新生兒圍生期死亡和后期神經發育損傷的重要原因，腦組織發生缺氧缺血后可誘導相關基因表達變化，觸發細胞內生化級聯反應，進而導致腦細胞功能退化，但HIE的具體發病機制尚未完全闡明。miRNA是一類非編碼小RNA，在真核生物中對基因表達起負調控作用，研究發現缺氧缺血可誘導腦組織miRNA的異常表達，介導機體發生轉錄后基因沉默[11]。Cui等[12]對新生大鼠HIE進行miRNA芯片的檢測和分析，發現有5種表達上調，30種表達下調。彭濤等[13]發現新生大鼠HIE腦組織中有27種miRNA表達上調，60種表達下調，均提示miRNA與HIE密切相關。本研究通過miRNA芯片技術比較HIE患兒與健康足月兒外周血漿的miRNA表達譜，在HIE組中共檢測出55種miRNA表達差異，其中29種表達上調，26種表達下調。利用Real-time PCR驗證6種miRNA在HIE組和健康對照組血漿中的相對表達量，結果顯示血漿中的miR-4472、miR-5195-3p、miR-6794-5p和let-7b-5p表達水平和芯片結果保持一致。進一步分析發現，HIE組中重度miR-4472、miR-5195-3p和miR-6794-5p表達較輕度組上調，而let-7b-5p表達下調。同時筆者也注意到，HIE組血漿miRNA表達水平較治療前呈現下調趨勢，表明miRNA有可能作為評價治療效果的因子。值得注意的是，目前研究最多miRNA-210已被證實是HIE的調控因子，但到底是危險因子還是保護因子仍意見不一。Qiu等[14]研究表明新生大鼠HIE腦組織中miRNA-210表達下降，提高腦組織miRNA-210水平可緩解腦損傷程度，而Ma等[15]研究顯示miRNA-210在新生大鼠HIE腦組織中表達上調，提高其水平反而更加重腦損傷程度。在本研究中，miRNA芯片未檢測到HIE組與健康對照組之間存在miRNA-210表達差異，產生上述研究結果差異的原因仍不清楚。本研究通過ROC曲線分析提示該4種血漿miRNA均對HIE有較好的診斷價值，以miR-6794-5p的診斷價值最高。本研究還發現miR-4472、miR-6794-5p的表達水平與HIE預后呈顯著相關，低表達組預后優于高表達組，說明miR-4472和miR-6794-5p可以一定程度上作為判斷HIE預后的有益補充。臨床上可根據HIE患兒miRNA表達水平對病情嚴重程度進行分類，指導臨床治療。目前，亞低溫治療已被證實是治療HIE的有效方法，但仍有近50%患兒經亞低溫治療后死亡或出現嚴重神經后遺癥[16-17]，因此迫切需要尋找新的治療途徑。Ma等[15]成功通過抑制腦組織miRNA的過度表達，改善了新生大鼠HIE腦損傷程度和預后，提示通過調節miRNA的異常表達，進而緩解下游信號傳導通路紊亂，可能是治療HIE的新方法。

綜上所述，本研究探討了HIE血漿中miR-4472、miR-5195-3p、miR-6794-5p和let-7b-5p的表達變化以及在HIE診斷、治療和預后中的價值，但其在HIE發病機制的作用尚有待研究。

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Expression profile of plasma miRNA in neonates hypoxic-ischemic encephalopathy and its clinical significance

ZHANG Xu，ZHU Wen，HE Mengzao，et al.Department of Pediatrics，Jiaxing Second Municipal Hospital，Jiaxing Children's Medical Center，Jiaxing 314000，China

Objective To screen the relevantp lasmam iRNA in neonates hypoxic-ischem ic encephalopathy(HIE),and to investigate its c linical significance. Methods A total of 117 neonates w ith HIE(inc luding 69 m ild cases and 48 moderate or severe cases)were enrolled in the study,30 full term healthy neonates served as healthy controls.The exp ression p rofile of p lasma m iRNA in three groups was exam ined w ith m iRNA m icroarray,then 6 m iRNAs were chosen for further validation by Real-time PCR.The exp ression ofm iRNA was compared among these groups,and the relationship between m iRNA exp ression and diagnosis,treatment and p rognosis of HIE was analyzed. Results The m iRNA m icroarray revealed that 55 m iRNA were differentially exp ressed in p lasma of HIE group,29 m iRNA were up-regulated and 26m iRNA were down-regulated.Compared to healthy controls,the exp ression ofm iR-4472,m iR-5195-3p,m iR-6794-5p was increased significantly in HIE g roup,while the exp ression of let-7b-5p dec reased significantly(all P＜0.01).The exp ression ofm iR-4472,m iR-5195-3p and m iR-6794-5p in moderate or severe HIE g roup was significantly higher,and the exp ression of let-7b-5p was lower than those in m ild HIE g roup (all P＜0.01).In m ild HIE g roup and moderate or severe HIE g roup,the exp ression m iR-4472,m iR-5195-3p and m iR-6794-5p was decreased,and the exp ression of let-7b-5p was increased marked ly after successful treatment(all P＜0.01).ROC curve showed that the area under the curve (AUC)of these 4m iRNAs were 0.958,0.938,0.986 and 0.969,respectively.The incidence of sequelae in HIE neonates w ith highly exp ressed m iR-4472 and m iR-6794-5p was significantly higher than that w ith low exp ression(both P＜0.05).The exp ression ofm iR-5195-3p and let-7b-5p was not correlated w ith p rognosis of HIE neonates(both P＞0.05). Conclusion The exp ression of m iR-4472,m iR-5195-3p,m iR-6794-5p in HIE g roup are significantly up-regulated,while let-7b-5p is down-regulated.The m iR-4472 and m iR-6794-5p m ight be used as biomarkers for p rognosis of HIE.

Hypoxic-ischem ic encephalopathy Neonate m iRNA

2016-10-19）

（本文編輯：陳麗）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.16.2017-1225

浙江省科技計劃項目（2013C33218）；浙江省人口計生委科研課題項目（JSW 2013-B033）

314000 嘉興市第二醫院兒科、嘉興市兒童醫學中心（張旭、朱雯、侯秋英、沈方方、張佩華、滕懿群）；杭州市第一人民醫院兒科（何夢藻）

滕懿群，E-mail：ten g y i q u n@163.com