大孔吸附樹脂法與高速逆流色譜法分離純化虎杖中白藜蘆醇的比較研究

程麗英，任紅濤，劉樹興

(1.鄭州工程技術學院 化工食品學院，鄭州 450044；2.河南農業大學 食品科學技術學院，鄭州 450002；3.陜西科技大學 食品與生物工程學院，西安 710021)

大孔吸附樹脂法與高速逆流色譜法分離純化虎杖中白藜蘆醇的比較研究

程麗英1，任紅濤2，劉樹興3

(1.鄭州工程技術學院 化工食品學院，鄭州 450044；2.河南農業大學 食品科學技術學院，鄭州 450002；3.陜西科技大學 食品與生物工程學院，西安 710021)

選擇大孔吸附樹脂法和高速逆流色譜法對虎杖中白藜蘆醇進行分離純化。通過實驗條件的優化以及對兩種方法的比較發現：經大孔吸附樹脂法分離純化所得的白藜蘆醇得率稍高，為0.21%，但純度偏低，僅為51%；經高速逆流色譜法分離純化所得的白藜蘆醇得率稍低，為0.186%，但純度大于96%，遠遠高于大孔吸附樹脂法所得。

虎杖；白藜蘆醇；大孔吸附樹脂；高速逆流色譜

虎杖是我國傳統的中藥，白藜蘆醇作為虎杖的有效成分具有抗氧化、抗菌、抗癌、預防心血管疾病等多種藥理活性，[1]越來越受到人們的重視。目前，關于虎杖中白藜蘆醇的提取及分離純化的方法研究較多，本文選擇大孔吸附樹脂法與高速逆流色譜法，對虎杖提取液中白藜蘆醇的分離純化進行比較研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料、試劑及儀器

虎杖，市購；白藜蘆醇標準品，外購；無水乙醇、甲醇、丙酮、氯仿、濃鹽酸、乙醚等皆為分析純；X-5、AB-8、NKA-Ⅱ、NKA-9、D-101樹脂，外購。

1.2 主要儀器和設備

高效液相色譜儀，美國Waters公司；TBE-300型高速逆流色譜(分離)儀，上海同田生化技術有限公司；752型紫外-可見分光光度計，上海精密儀器有限公司；RE-52A型旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；玻璃層析柱，成都玻璃儀器廠；JA5003型電子天平，上海精科儀器有限公司；PHS-3C型精密pH計，上海雷磁儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 分析方法

對白藜蘆醇標準品進行紫外圖譜掃描，確定白藜蘆醇紫外最大吸收峰，通過對白藜蘆醇的紫外分光測定、硅膠薄層層析、紫外圖譜掃描及高效液相色譜[2-3]測定，建立紫外分光光度計跟蹤檢測、薄層層析、紫外圖譜掃描及高效液相色譜定性定量測定的方法。

1.3.2 白藜蘆醇粗提液的準備[4]

將干燥片狀的虎杖根莖進行粉碎處理，然后過60目篩。根據前期實驗結果，稱取一定量粉碎合格的虎杖原料，按料液比1:20(g/mL)，加入體積分數80%的乙醇與丙酮1:1混合溶液，調整pH為4，在40℃條件下回流提取30min，共提取2次，然后抽濾，棄去濾渣，合并濾液。之后經旋轉蒸發儀回收有機溶劑，得到虎杖有效成分的粗提物備用。

1.3.3 分離純化

大孔吸附樹脂法分離純化：選擇5種不同的大孔吸附樹脂對虎杖提取液進行靜態及動態吸附解吸實驗，確定白藜蘆醇分離純化最適合的大孔吸附樹脂及吸附解吸條件。

高速逆流色譜法分離純化：考察不同的溶劑系統，根據虎杖中白藜蘆醇分離純化的結果選出最佳的溶劑系統及分離條件。[5-6]

1.3.4 高效液相色譜測定

將利用大孔吸附樹脂法及高速逆流色譜法分離純化所得產品進行高效液相色譜分析，根據面積外標法得出白藜蘆醇含量，并計算求得產品純度及得率。產品純度為白藜蘆醇質量(有效成分收集液的濃度×收集液體積)與有效成分收集液濃縮烘干后的固形物質量之比，得率為白藜蘆醇質量與虎杖干重之比。

2 結果與討論

2.1 白藜蘆醇的標準曲線方程

根據白藜蘆醇標準品的紫外掃描圖譜(圖略)，選擇306nm作為白藜蘆醇的測定波長。通過測定不同濃度白藜蘆醇標準品在306nm下的吸光度，經計算得出白藜蘆醇標準曲線方程為：y=7.6582x+0.0003(y為濃度，μg/mL；x為吸光度)，相關系數R2=0.9979。

2.2 大孔吸附樹脂的篩選[7]

樹脂吸附解吸量的大小是大孔吸附樹脂法分離純化的關鍵。本實驗選取5種大孔吸附樹脂經預處理后對虎杖提取液中的白藜蘆醇進行靜態吸附與解吸實驗，結果見表1。

表1 不同樹脂對白藜蘆醇的吸附解吸性能

由表1可以看出，NKA-Ⅱ樹脂的吸附率最高，其次為NKA-9，其他三種樹脂吸附性能較差。在解吸方面，AB-8樹脂最好，NKA-9次之。考慮到NKA-9樹脂的吸附率和解吸率都較高，故選擇NKA-9作為最佳樹脂進行動態吸附解吸實驗。

2.3 大孔吸附樹脂法吸附條件的確定

2.3.1 料液濃度對吸附效果的影響

分次取18mL樹脂濕法裝柱，制取6份含白藜蘆醇總量相同且高于該樹脂飽和吸附量但濃度不同的虎杖提取液，上大孔吸附樹脂柱進行動態吸附測定，結果見圖1。由圖1可以看出，在白藜蘆醇總量相同的情況下，隨著上柱濃度的增大，吸附率先增大后減小， 3～4mg/mL上柱濃度時吸附率最高，吸附量最大。因此，選擇上柱濃度在3～4mg/mL之間。

圖1 料液濃度對吸附率的影響

2.3.2 上柱速率對吸附率的影響

用蠕動泵分別控制6個不同的流速進行上柱吸附，通過上柱前后溶液有效成分的濃度差，計算吸附率，結果見圖2。可以看出，上柱速率越大越不利于吸附，但上柱速率過小樹脂吸附消耗的時間就多，當上柱速率超過1.0mL/min后，吸附率明顯下降。綜合考慮吸附率及效率，選擇流速為1.0mL/min，即3.3BV/h。

圖2 上柱速率對吸附率的影響

2.3.3 上樣量對吸附率的影響

分次吸取2mg/mL濃度的粗提液樣品7mL，8mL，9mL，10mL，11mL和12mL，上樣于NKA9大孔吸附樹脂的色譜柱中，靜置15min，用蒸餾水淋洗至析出液無色，再用75%乙醇溶液洗脫，收集洗脫液，測定并計算吸附率。由圖3可以看出，當上樣量為8mL時吸附效果最好。上樣量繼續增大，則超過了樹脂的飽和吸附量，吸附率反而下降。因此，選擇上樣量為8mL，即0.45BV。

圖3 上樣量對吸附率的影響

2.3.4 進樣 pH值對吸附率的影響

分別調整不同的樣液pH，進行上樣吸附，并測定吸附率，結果見圖4。由圖4可以看出，隨著pH增加，吸附率先增加后下降，在pH4時，吸附率達到峰值。因此，確定上柱液的pH為4用于操作。

圖4 pH對吸附率的影響

2.4 大孔吸附樹脂法解吸條件的確定

2.4.1 解吸劑濃度的確定

分別選擇體積分數20%、35%、50%、75%、100%的乙醇溶液對已經吸附有效成分的樹脂進行洗脫，結果見圖5?？梢钥闯觯S著乙醇濃度的升高，白藜蘆醇的解吸率也隨之升高，當濃度上升到75%以上時，解吸率增加不明顯。故選用75%乙醇溶液進行解吸操作。

圖5 不同濃度乙醇對解吸的影響

2.4.2 洗脫流速對解吸效果的影響

以不同流速的75%乙醇對吸附樹脂進行解吸，結果見圖6?？梢钥闯觯馕孰S流速的增大而減小，但隨著流速的增大，生產效率會提高。綜合考慮，確定洗脫流速為0.9mL/min，即3BV/h。

圖6 洗脫流速對解吸的影響

2.4.3 洗脫劑的pH值對解吸效果的影響

考慮到白藜蘆醇為偏酸性物質，偏堿性條件有利于白藜蘆醇的解吸，因此選擇pH7，pH8，pH9，pH10，pH11對白藜蘆醇的解吸情況進行考察，結果見圖7。由實驗結果發現，解吸液在pH8效果最好。

2.4.4 動態解吸曲線

選擇上柱液濃度3mg/mL，上柱量7mL。充分吸附后，以上述實驗選擇的解吸條件進行解吸操作，以解吸液體積為橫坐標，白藜蘆醇濃度為縱坐標，繪制解吸曲線，見圖8。可以看出，有效成分大都在10～60mL的洗脫液中，隨著乙醇的繼續洗脫，剩余少量的白藜蘆醇也逐漸被解吸下來，共需解吸液約135mL，即7.5BV(樹脂床體積)。

圖7 pH對解吸的影響

圖8 白藜蘆醇解吸曲線

2.5 高速逆流色譜法分離純化白藜蘆醇

2.5.1 溶劑體系的確定[8]

高速逆流色譜法分離純化白藜蘆醇的關鍵在于溶劑系統的選擇。本文比較了兩種不同的溶劑系統，一種是氯仿、甲醇、水系統，其比例為4:3:2；另一種是乙酸乙酯、乙醇、水系統，其比例為10:1:10。結果發現，第一種溶劑系統對于虎杖中的有效成分分離效果較好。因此，選擇氯仿、甲醇、水的比例為4:3:2作為高速逆流色譜法分離純化虎杖中白藜蘆醇的溶劑體系。

2.5.2 分離條件的確定

經綜合考察與比較，選擇轉速850r/min，流速2mL/min，進樣量5mL提取液，紫外檢測波長280nm作為分離條件。在確定的溶劑體系及分離條件下所得虎杖提取樣品的高速逆流色譜見圖9?？梢园l現，虎杖粗提物經過逆流色譜分離純化得5個組分。分別收集，經薄層檢測及紫外圖譜掃描，發現第五個峰所得物質為白藜蘆醇，且純度較高。

2.6 白藜蘆醇的高效液相色譜分析

將通過大孔吸附樹脂法及高速逆流色譜法分離純化所得的白藜蘆醇產品上高效液相色譜柱，經高效液相色譜測定，利用大孔吸附樹脂法分離純化所得白藜蘆醇得率為0.21%，純度為51%；利用高速逆流色譜分離純化所得白藜蘆醇得率為0.186%，純度大于96%。白藜蘆醇的高效液相色譜圖見圖10。

圖9 虎杖提取樣品高速逆流色譜圖

圖10 白藜蘆醇樣品高效液相色譜圖

3 結論

(1)本實驗考察了5種大孔吸附樹脂對虎杖中白藜蘆醇的吸附解吸性能，發現NKA9樹脂對白藜蘆醇有較好的吸附和解吸效果。針對NKA9型樹脂進行了吸附解吸工藝條件的優化，純化工藝為：上樣濃度4mg/mL，上樣速率3.3BV/h，上樣量0.45BV，pH4條件下吸附；解吸采用7.5BV的75%酒精，洗脫流速3 BV/h，pH為8。

(2)優化了高速逆流色譜法分離純化虎杖中白藜蘆醇的工藝條件。選擇氯仿、甲醇、水的比例為4:3:2作為溶劑體系，轉速850r/min，流速2mL/min，紫外檢測波長280nm。

(3)通過對大孔吸附樹脂法及高速逆流色譜法分離純化虎杖中白藜蘆醇的比較發現，大孔吸附樹脂法作為低成本的分離純化方法，所得白藜蘆醇成品的得率為0.21%，純度為51%，純度較低；高速逆流色譜法相對生產周期短，所得白藜蘆醇得率為0.186%，純度大于96%，純度較高，具有一定的應用推廣價值。

[1]馬超，郝青南，馬兵鋼.白藜蘆醇的藥理功能及分離檢測研究進展[J].北方園藝，2008(4):61-65.

[2]郭金鳳,崔一民.薄層層析法鑒別虎杖中的成分[J].中國藥事, 1997, 11(1): 52-53.

[3]馮濤，劉鵬，劉海燕，等.雙波長高效液相色譜法檢測虎杖中活性成分[J].廣州化工，2015(6):106-108.

[4]葉秋雄，黃葦.虎杖中白藜蘆醇提取工藝研究[J].現代食品科技， 2013(6):1324-1327.

[5]魏云,曹學麗.值得關注的分離科學技術：逆流色譜技術[J].世界科學技術, 2001,3(5): 17-23.

[6]孫力,于魯海.逆流色譜技術在植物藥活性部位分離方面的應用[J].中國藥房, 2003,14(4): 200-201.

[7]田娜，周達力，曹佩琴，等.大孔吸附樹脂對白藜蘆醇的分離純化研究[J].中國農學通報，2013(22):147-151.

[8]陳雷，楊福全，張天佑，等.虎杖中白藜蘆醇和白藜蘆醇甙的高速逆流色譜分離提純及其分析[J].分析測試學報，2000(7):60-62.

(責任編輯 姚虹)

Comparative Study on Separation and Purification of Resveratrol from Polygonum Cuspidatum by Macroporous Adsorption Resin and HSCCC

CHENG Li-ying1, REN Hong-tao2, LIU Shu-xing3

(1.College of Chemical Engineering and Food, Zhengzhou Institute of Technology, Zhengzhou450044, China；2. College of Food Science & Technology, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China；3.College of Food & Biological Engineering, Shanxi University of Science and Technology, Xi’an 710021, China)

In this paper, two methods are selected to separate and purify of the resveratrol from Polygonum cuspidatum, macroporous adsorption resin method and HSCCC method. Through the optimization of experimental condition and the comparison of two methods, the results are as follows: The resveratrol yield is slightly higher by the macroporous adsorption resin purification, it is 0.21%,while the purity is low, only 51%; the resveratrol yield is slightly lower by the HSCCC method, and it is 0.186%. However, the purity by HSCCC is over 96%, which is much higher than macroporous adsorption resin purification.

Polygonum cuspidatum ; resveratrol; macroporous adsorption resin; HSCCC

2017-06-13

程麗英(1980—),女，河北石家莊人，工學碩士，鄭州工程技術學院化工食品學院講師，研究方向為食品科學。

10.13783/j.cnki.cn41-1275/g4.2017.04.024

TQ461

A

1008-3715(2017)04-0113-04